基于 Q-Marker 理论的化学标识物研究及应用(2)

　　胶类的主要成分为动物皮类胶原蛋白水解后形成的多肽。皮类胶原蛋白主要由Ⅰ型胶原蛋白组成，占胶原蛋白总量的80%～85%，Ⅰ型胶原蛋白又包括Ⅰ型α1、α2亚型。通过对驴、牛、马、骡等动物的Ⅰ型α1、α2胶原蛋白序列进行blast多序列比对，发现胶原蛋白COL1α2之间存在序列差异，进一步模拟胰蛋白酶酶切胶原蛋白分别获得驴皮、牛皮、马皮特征肽［29-32］，作为化学标识物。笔者对马皮特征肽进行了研究，获得化学标识物———马源寡肽A。

　　2.2.1化学标识物———马源寡肽A确定通过对马与驴、猪、牛、羊的Ⅰ型α1、α2胶原蛋白序列进行blast多序列比对，发现了胶原蛋白COL1α2之间的差异序列，进一步模拟胰蛋白酶酶切胶原蛋白获得一条理论的马相对于驴、猪、牛、羊胶原蛋白的特征肽—马源寡肽A(序列为GASGPAGVＲ)。

　　采用高分辨质谱对制备的马皮胶进行分析，将获得的数据用Thermo Proteome Discovery 2.0软件以马胶原蛋白COL1α2序列(gi|953850624|ref|XM_001492939.3)为数据库进行搜库分析，证实了马源寡肽A的存在。为了考察供应量大、价格便宜的易用于掺假的皮类原料中是否含有马源寡肽A，在NCBI数据库里进行了Blast(the basic local align-ment search tool)比对分析，结果显示，在驴、牛、猪、羊等常见家畜没有该性特征肽序列。

　　委托合成马源寡肽A，将马皮胶样品以及合成的马源寡肽A的提取离子流图、二级质谱图进行比较，见图3，在提取离子流图中马皮胶样品与合成的马源寡肽A色谱峰的保留时间一致，二级质谱图中离子碎片信息也一致。马源寡肽A二级质谱碎片信息归属与理论一致，见图4。

　　为了确证所合成马源寡肽A的序列准确性，委托公司采用Edman降解法对马源寡肽A进行了N端序列测定。结果，马源寡肽A合成品的序列为Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Arg(GASGPAGVＲ)，与目标特征肽序列一致。

　　2.2.2在阿胶杂皮投料生产问题中的应用目前阿胶的牛皮源补充检验方法就是以牛皮特征肽作为化学标识物，对牛皮投料问题进行检查;而现行的阿胶鉴别方法中，以正品阿胶作为对照药材，选择的肽段为驴、骡共有，专属性不强，无法有效鉴别是否存在骡皮投料生产问题，而以马源寡肽A作为化学标识物，对阿胶进行检查，可以有效检测出是否存在马皮和骡皮代替驴皮投料问题，专属性强。

　　2.3皂矾正伪品的化学标识物研究

　　《中国药典》2015年版规定，皂矾为硫酸盐类矿物水绿矾的矿石，主含含水硫酸亚铁(FeSO·7H O)。目前市场上流通的皂矾多为化学合成品，而化学合成品FeSO·7H O多为酸法钛白粉生产的副产品，除了含有硫酸亚铁外，还含有多种杂质，安全性无法得到保证。笔者对市售皂矾进行了研究，获得化学标识物-二氧化钛。

　　2.3.1仪器及材料OPTIMA8000电感耦合等离子体发射光谱仪(美国PE公司);MAＲS 6微波消解仪(美国CEM公司);Mettler AE240电子天平(瑞士梅特勒公司)。钛标准溶液购自国家有色金属及电子材料分析测试中心(标准物质号:GSB 04-1757-2004，批号:187022，标准值:1 000μg·mL－1)，皂矾样品均为安徽亳州及河北保定药材市场收集。

　　2.3.2化学标识物-二氧化钛的确定采用ICP-OES法对20批市售皂矾的TiO2含量进行测定。结果，20批皂矾中二氧化钛含量存在显著差异。进行主成分分析［33］，可以发现20批样品明显分为两类，13批样品聚为一类，TiO2含量在0.22%～0.90%之间，平均值为0.5%;其他7批聚为一类，TiO2含量在0.000 3%～0.000 7%之间，平均值为0.000 5%，两类皂矾中TiO2含量差异显著，平均值约相差1 000倍，20批皂矾的含量测定结果见表1。因此，可以二氧化钛作为化学标识物对皂矾和化学合成品进行区分。

　　对于主成分分析图中合成皂矾样品离散程度较大问题，合成皂矾是酸法钛白粉生产的副产品，相关企业进行净化处理可以达到不同的纯度，用于净水、饲料、添加剂等不同的用途，不同纯度的合成皂矾中二氧化钛含量存在较大差异，因此出现检测数据离散程度较大问题。

　　2.3.3在不同来源皂矾鉴别中的应用目前皂矾现行质量标标准中的检验项目无法对天然皂矾和合成皂矾进行区分，而以二氧化钛作为化学标识物进行检查，可以有效区分皂矾的来源。

　　3化学标识物研究在中成药中的应用

　　中成药的处方药味一般较多，多种药味混合在一起，常用的基于药材的鉴别方法容易受到限制，鉴别效果不理想，而化学标识物方法由于其较强的专属性和单一性，更加适用于中成药。以本研究的化学标识物为代表，在相关中成药中进行应用研究。

　　3.1女金丸中老瓜头代替白薇投料问题的研究

　　3.1.1仪器及材料岛津LC－20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，二极管阵列检测器;Mettler AE240电子天平(瑞士梅特勒公司)。女金丸样品为2017年国家药品评价性抽验样品。

　　3.1.2色谱条件色谱柱:Kromasil 100-5 C18谱条件:以甲醇为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱(0～10 min，20%A→30%A;10～25 min，30%);体积流量1 mL·min－1;检测波长280 nm;柱温35℃。进样量为10μL。

　　对照溶液的制备:取老瓜头药材粉末0.4 g，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，滤过，取续滤液，即得。

　　供试品溶液的制备:取女金丸40 g，加硅藻土20 g，研细，称取30 g，加甲醇100 mL(蜜丸)或150 mL(水蜜丸)，超声处理30 min，滤过，蒸至近干，残渣加水10 mL使溶解，用脱脂棉滤过，滤液通过D101型大孔树脂柱(16～60目，内径为1.5 cm，柱高为15 cm)，流速1.0～1.5 mL，以水50 mL洗脱，弃去洗脱液，继用甲醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，滤过，取续滤液，即得。

　　3.1.3测定及结果分析以β-D-呋喃果糖基-(2→1)-α-D-［6-O-芥子酰基］-吡喃葡萄糖苷作为化学标识物，采用高效液相色谱法，建立女金丸中老瓜头的检查方法，对女金丸中是否存在老瓜头代替白薇投料问题进行研究，结果发现，在2017年国家药品评价性抽验中收集到的215份女金丸样品中，111份样品中检出该成分，说明女金丸中存在老瓜头代替白薇投料问题。

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