Schneider等[7]基于短杆菌肽S-合成酶PheA(Phenyla-lanine-activating)的晶体数据,分子模建了拟南芥At4CL2的蛋白质模型,鉴定了参与At4CL2 SBP的12个氨基酸残基,创造了“功能的获得”(Gain-of-function)突变体,通过增加SBP的空间大小产生了具有转化阿魏酸和芥子酸能力的At4CL2突变体,而通过增加SBP的疏水性导致具有强烈增强的肉桂酸转化的At4CL2突变体。
上述研究结果对于更好地理解苯丙烷类衍生物途径中关键酶的催化过程,对于设计具有新的底物特异性的4CL突变体有很好的帮助。但这些都没有从根本上揭示4CL同工酶的底物特异性和偏好性的分子机制。要阐明4CL蛋白的催化机制,最佳方法就是获得4CL蛋白的晶体,并通过X-衍射收集4CL晶体的结构数据,解析4CL蛋白的原子结构,从而更好地解释4CL蛋白的结构与功能的关系。
34CL蛋白晶体学研究现状
3.1晶体生长的基本原理和方法
蛋白质晶体生长的基本原理是指蛋白质溶液在过饱和状态下,蛋白质在固相沉积的速率大于离开固相进入液相的速率时,溶液中蛋白质分子就会自我聚集成核,在合适的条件下,形成的晶核发育成蛋白质晶体。蛋白质晶体通常在过饱和状态下出现,蛋白质能达到过饱和状态而不是在达到饱和态就立即沉淀或者结晶出来,主要是因为蛋白质结晶也有类似于化学反应的能垒,成核是一个高能态,使得蛋白质成核过程较慢。能垒越高,蛋白质形成临界核的速度就越慢,过饱和状态就越容易维持。同时蛋白质溶液过饱和状态越高,蛋白质形成临界核的可能性就越大。结晶的方法分为4种:批量结晶、蒸发结晶、液液扩散结晶和透析结晶[8]。
3.2蛋白质晶体解析方法
蛋白质空间结构与其生物活性的关系是结构生物学的核心。空间结构对酶的功能至关重要,即使极其细微的扰乱也会导致酶活力的丧失。结构与功能关系的研究,一直是蛋白质研究的核心问题之一。1960年Max Perutz解析出了第1个蛋白质结构——血红蛋白质的三维结构。这之后蛋白质结构解析工作逐渐开展起来[9]。蛋白质晶体结构测定可以提供原子(或接近)分辨率的三维精细结构。经过修正的高于1■分辨率的蛋白质结构,可以确定其结构中的原子的空间坐标及原子之间的关系(如氢键)、结构表面及内部的溶剂分布,以及分子柔性或运动的变化[10]。目前,可用于完整、准确、实时测定生物大分子三维结构的主要方法包括:X射线晶体结构分析、多维核磁共振(NMR)波谱解析和电子显微镜二维晶体三维重构(电子晶体学,EC)。
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