论土壤微生物的宏基因组学及其研究进展(2)

　　 
　　３土壤宏基因组研究现状 
　　 
　　利用宏基因组学的技术，科研人员筛选到了许多功能基因，加拿大TerraGen Discover公司最先在以链霉菌为宿主的宏基因组文库中筛选到了具有抗菌活性的5种新的小分子物质TerragineA、B、C、D、E[5]；Courtois等利用柯斯载体构建了含5 000个克隆子的环境基因组文库，采用PCR 序列分析的方法，筛选出编码聚酮合成酶的新基因，同时采用HPLC技术发现了脂肪二烯醇中2种新的化合物，两者互为同分异构体；Yun等选用pUC19为克隆载体构建大肠杆菌基因组文库，利用活性筛选方法，从30 000个重组子中筛选出1个含淀粉酶基因（amyM）的克隆子。 
　　2005年，LimHK等以枯草芽孢杆菌为宿主，建立了森林土壤的宏基因组文库，筛选到2个具有抗菌活性的克隆，对其结构进行分析，得出其中一个为产红色色素的靛玉红，另一个为产蓝色色素的靛蓝，是靛玉红的异构体。2006年，VogetS等首次研究了从土壤宏基因组文库中筛选到的一种纤维素酶的性质，证实了其具有较广的pH值和温度适应范围，并且在较高的盐度时也具有活性，具有工业应用价值。 
　　４土壤宏基因组学的技术局限性 
　　 
　　总DNA提取技术尚存在一定的限制，土壤环境中，由于微生物与土壤颗粒紧密结合的特性以及腐殖酸等抑制性物质存在等原因，从中难以获得适于构建宏基因组文库的高分子量DNA。Bertrand等采用间接提取法，通过Nycodenz梯度离心，所回收的土壤DNA片段大小己能达到400kbp，但至今基于原位裂解获得>100kbp土壤DNA的提取技术尚未突破，运用原位裂解法构建更大片段环境宏基因组文库（现有的土壤宏基因组文库中，平均插人片段最大为44.5kb）仍是一个难点。不可避免地，环境宏基因组文库所包含微生物基因组信息的偏差将直接导致“基因遗漏”现象发生，如海洋中普遍存在的微生物固氮基因，却在测序量高达1.6Gbp的马尾藻海水宏基因组文库中被遗漏，表明仅运用宏基因组学技术同样会忽略部分的微生物资源。 
　　阳性克隆筛选频率低是宏基因组学的另一个瓶颈所在，运用经典的功能筛选方式，往往是在数千个，甚至数百万个重组克隆子中才能检测到有用的活性克隆，造成此局面一个重要的原因是外源基因的异源表达水平低下。目前根据核酸序列相似性及基因保守区设计探针或引物的杂交、PCR筛选方法，从文库中发现新基因的比率尚不到已知基因的40%。 
　　环境微生物宏基因组研究能让我们发现存在于不可培养微生物中的一些重要的生理过程。许多实验室已经开始努力从不可培养土壤生物的基因组序列中去获得重要的基因，特别是从Acidobacterium组中，因为它是土壤中最常见的细菌。这些数据提供了关于这些生物在土壤中扮演角色的线索。随着足够序列信息的获得，这些生物的代谢途径将被构建出来，引导我们采取有效的策略去培养这些生物。这些数据也将准许我们构建包含所有已知开放阅读框的微生物芯片，来确定这些基因在时间和空间上的表达状况。 
　　尽管宏基因组技术本身还存在着一些局限性，但它为土壤微生物的研究提供了一种有效的研究策略，尤其是对于９９％以上不能获得纯培养的土壤微生物来说，宏基因组学不仅是研究土壤微生物生态学的坚实基础，更是我们获得土壤中各种基因资源的一个有效手段。 
　　 
　　5 参考文献 
　　[1] HANDELSMAN J，RONDON M R，BRADY SF，et al.Molecular biological access to the chemistry of unkown soil microbes：a new frontier for natural products[J].Chen Biol，1998，5（10）：245-249. 
　　[2] VOGET S，LEGGEWIE C，UESBCK A，et al.Prospecting for novel bicoatalysts in a soil metagenome[J].Appl.Emiron.Microbiol，2003（69）：6235-6242. 

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