2.3 α- 平滑肌肌动蛋白(α-actin)、肌球蛋白(myosin)、结蛋白(desmin)的鉴定
肌动蛋白是一种具有收缩能力的微丝蛋白在真核细胞中普遍存在，含量丰富，依其氨基酸序列和构型的不同而有不同的类型，至少存在6种亚类，其中两种广泛存在于肌肉与非肌肉细胞的胞浆中，称为β和γ肌动蛋白 另外4种主要分布于肌细胞中，统称为α-actin ，按分布的不同 ,又分为横纹肌的α-S-actin ,心肌的α-C-actin ,血管平滑肌的α-SM-actin,胃肠道平滑肌的α-γ-actin四种。阴茎海绵体平滑肌细胞属于α-SM-actin。平滑肌特异性的平滑肌肌动蛋白单克隆抗体进行免疫组化染色，是鉴定CMSC的特异性标记。而myosin是粗肌丝的主要组成成分，Desmin是中间丝的主要成分，都是平滑肌细胞的良好标志 [9] 。
陈斌等[9]用SABC法，分别用子宫肌瘤平滑肌标本作为α-actin、myosin、desmin的阳性对照，以大动脉作为Ⅷ因子阳性对照，每次实验均以PBS代替一抗作为阴性对照。α-actin和myosin免疫组化染色显示培养的细胞、均呈现阳，而desmin及Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色为阴性。将培养传代的细胞移入不含血清的DMEM培养基培养后，再次做结蛋白免疫组化 ，则出现抗结蛋白免疫组化染色阳性结果,免疫组化α-actin、myosin、desmin染色阳性细胞数总体可达95％。 冯超等[14]观察第一代细胞荧光显微镜下对α-actin、myosin仅有少量表达。第五代细胞对α-actin、myosin几乎无阳性表达。经过多次贴块培养后细胞对阳性率进一步降低。 宋鲁杰等[15]荧光显微镜下观察到a-actin和Myosin仅有少量表达 ，随传代次数的增加，细胞表达a-actin和 Myosin的阳性率进一步降低。 Abeysinghe HR等[16]得出第二代平滑肌细胞经免疫荧光检测显示α-actin、myosin、desmin均呈阳性反应。但后两者的荧光强度弱于α-actin。同期制备的兔成纤维细胞仅α-actin呈现阳性反应，余下指标均显示阴性。Giovanni等[17]报道的培养方法，培养成功后CMSC其纯度通过检测证实阳性可达α-actin可达97％。
国内多采用α-actin单个指标作为鉴定平滑肌细胞鉴定的标准，且对抗体阳性率的计算方法没有进行很好的阐明[12、13] ,从目前的文献上来看α-肌动蛋白是一个非常特异性的指标。Pilatz[8]等更倾向于将结蛋白作为鉴别平滑肌细胞的特异性指标。Rajasekaran [18]还支持将α-肌动蛋白结合肌球蛋白作为鉴定平滑肌细胞的指标。Abeysinghe HR研究同期成纤维细胞在这两项指标的检验中均提示阴性，并在进行流式细胞纯度分析的全过程中始终低于α-肌动蛋白表达的阳性率[16],因此可以认为利用desmin结合α-actin是用来鉴别海绵体平滑肌细胞有效的指标。有趣的是，Krall等[5]曾指出结蛋白会在体外培养的时候消失,但把细胞移入不含血清的培养液中继续培养,则又可以诱导细胞合成desmin，陈斌等[9]通过实验得出类似的结论。 Kolodsick[19]认为成纤维细胞体外培养时有向肌纤维母细胞转化的趋势, 在这个过程中α-actin也是表达的，这可能是以往研究中CMSC假阳性的一个重要原因。
3 展望
优化CMSC培养的鉴定方法，为研究ED的细胞培养纯度提供保证。但是现在各种鉴定方法特异性值得进一步商榷，其阳性率有待提高，根据CMSC和成纤维细胞细胞膜差异蛋白表达的情况，运用流式分选技术鉴定纯度较高，将是今后研究的方向，另外几种方法联合鉴定可以提高阳性率，逐步提高细胞纯化度，会促进ED病理生理机制的研究新进展，从而促进ED研究和指导临床治疗。
参考文献
[1] Jardin A．Erectile Dysfunction[M].Plymouth ; Health Publication Lid,2000．711-726．
[2] Feldman HA，Johnnes CB，Derby CA，et al．Erectile dysfunctionand coronary risk factors：prospectiveresults from the Msachusetts male aging study[J]．Prey Med，2000，30(40)：328-338．
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