2024CB964800-G造血干细胞维持、衰老与再生的调控机制研究 - 图(3)

础上，研究成果服务于对抗衰老、促进再生的整体目标，为课题一至三提供调控临床应用的最终落脚点。

课题一：成体HSC稳态维持的内外调控机制 研究目标:

1、 利用本团队已建立的基因敲除或转基因小鼠模型探讨Puma、iASPP等p53通路相关基因对HSC的稳态维持及分化潜能调控的作用机制。

2、利用已建立的基因单敲除、双敲除小鼠模型探讨p16、p18等p16-pRb途径相关基因对幼鼠、成年鼠及衰老小鼠HSC的数目及稳态维持等功能的调控作用及调控机制。

3、利用ATF-/-小鼠及骨髓MSC数量减少或功能缺失的小鼠模型，探讨成骨细胞、间充质干细胞等干细胞巢组成成分及其分泌因子对HSC的稳态维持的调控作用机制。 研究内容:

1、Puma基因对HSC的自我更新和稳态维持的调控作用

程涛课题组已经引进了Puma基因敲除的小鼠模型并已将其回交到纯系小鼠C57BL/6的遗传背景上。在此基础上,拟进行以下内容的研究.

A．利用流式细胞术分析在Puma基因敲除的小鼠模型中，幼鼠、成年鼠及衰老小鼠HSC的免疫表型及数目、HSC的细胞周期及CKI蛋白的表达情况。

B． 利用Puma基因敲除的小鼠模型，通过竞争性骨髓移植实验方法分析Puma

缺失对不同阶段的小鼠造血干细胞的功能，特别是自我更新的能力的影响。

C． 分离Puma基因敲除小鼠的HSC，在体外利用单细胞培养实验对HSC的增

值动力学及分化潜能进行分析。

D． 根据上述实验，构建逆转录病毒载体，采取干扰的方法降低正常干细胞Puma

基因的表达水平，再进行HSC连续移植实验，观察对HSC移植率的影响。采取竞争移植方法观察降低Puma基因表达对重建造血的影响。 2、iASPP基因对HSC的自我更新和稳态维持的调控机制研究 A．iASPP对HSC抗凋亡、衰老作用研究

1）iASPP转基因小鼠及littermate control小鼠，分别接受3Gy照射，照射后6小时和24小时，取骨髓，使用流式细胞仪分析HSC/HPC凋亡、衰老情况，进行H2AX抗体染色，分析DNA断裂数量。

2）连续HSC移植。iASPP转基因小鼠及littermate control小鼠，取骨髓细胞，移植入致死剂量照射的同系小鼠中。造血重建后，再次取受体小鼠骨髓细胞进行下一轮HSC移植，依次重复。

经过这些研究可以明确iASPP是否会抑制造血干细胞受到DNA损伤后的凋亡、衰老，有助于HSC的存活，使受到损伤的HSC积累更多的突变，促进衰老的发生。

B. iASPP在HSC自我更新、多向分化和增殖中的作用

根据免疫表型分析iASPP转基因小鼠HSC和HPC的比例和数量及竞争移植实验评价iASPP在造血干细胞自我更新、多向分化和增殖中的作用。 C、iASPP在HSC归巢中的作用

体外归巢能力评价：取iASPP转基因小鼠及littermate control小鼠的lin-c-kit

＋

Sca-1＋造血细胞进行transwell实验，体外评价iASPP对HSC归巢能力的影响。

3、p16-pRb对HSC维持、衰老及再生的调控机制研究

前期研究发现，此通路中的p16及p19在连续移植的小鼠细胞中（〉30个月）高表达，而仅几轮骨髓移植后, p16-/-组HSC的自我更新能力和对照组没有差别，提示在小鼠衰老过程发生前,p16并不是一个敏感的生物标记.而p21在静息态的HSC高表达，所以在HSC的衰老中不起必须性的作用。但p21-/-小鼠HSC大量进入增殖周期，绝对数量增加，这和造血系统衰老时HSC的表现类似，而且在反复移植压力下，最终受体小鼠亦出现了造血功能衰竭。而p18的敲除或抑制可以逆转由于p21缺乏导致的造血衰竭现象。由此我们推测p21和p18 有可能是作用相反的两个开关，在HSC衰老及再生的过程中共同调节HSC的

数目及功能，为了验证这一假设，拟进行以下内容的研究。

A．利用realt ime-PCR及western blot分别在RNA及蛋白水平检测幼鼠、成年鼠及衰老小鼠的p18/p21的比例及p16 p19的水平。

B．利用体外HSC的长周期培养、单细胞培养实验及体内重建造血实验、骨髓竞争移植实验等评价p18-/-或p21-/-的幼鼠、成年鼠及衰老小鼠的HSC及其干细胞巢的功能

C．用基因芯片技术对不同CKI单基因及双基因敲除模型的幼鼠、成年鼠及衰老小鼠的基因表达水平进行分析

4、ATF-4对HSC维持、衰老及再生的调控机制研究

课题组已经建立了ATF—4基因敲除小鼠模型。利用该模式动物拟进行以下内容研究，最终阐ATF-4对HSC维持、衰老及再生的调控机制

A. 分离ATF-4-/-小鼠的HSC后，研究HSC/HPC细胞周期的特点，并从细胞周期调控蛋白的水平、功能等方面研究该模型HSC细胞周期调控的机制与特点。 B.利用体外HSC的长周期培养、单细胞培养实验及体内重建造血实验、骨髓竞争移植实验等评价ATF-4-/-小鼠的HSC及其干细胞巢的功能。

C.用基因芯片比较ATF-4-/-小鼠和正常小鼠HSC基因表达的差异，并用实时定量PCR加以验证。根据实验得到的结果，选择1－2个目的基因进行干预，观察对HSC数目及功能的影响。

5、骨髓间充质干细胞（MSC）对HSC维持、分化及衰老的调控作用机制 A．建立骨髓MSC数量减少或功能缺失的动物模型。

MSC表达多种表面分子，其中HOP-26 (CD63)、CD49a 和SB-10 (CD166) 可以作为MSC的标志。分别建立HOP-26、CD49a 或SB-10 单基因或双基因缺陷小鼠，然后分别研究它们骨髓MSC改变的情况，筛选出最佳的骨髓MSC数量减少或功能缺失的动物模型。

B． 研究MSC数量减少或功能缺失导致的HSC以及成熟血细胞的变化。

收集基因缺陷小鼠的骨髓细胞和外周血，流式细胞仪检测造血干/祖细胞以及淋巴细胞系、髓系、红系等细胞的比例，分离干/祖细胞研究其集落形成能力及造血重建能力。

C．研究同基因和异基因HSC和MSC共移植模型治疗骨髓衰竭的作用。

将同基因和异基因HSC和MSC单移植和共移植至致死量和亚致死量辐射动物体内，观察这两种干细胞移植对动物辐射损伤后的不同治疗作用，重点探讨MSC移植在重建造血及其微环境中的作用及其机制。 经费比例: 30%

承担单位: 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 课题负责人:程涛

学术骨干: 王敏，袁卫平, 高瀛岱

课题二：HSC衰老的关键分子及调控机制 研究目标:

课题总的研究目标是利用基因敲除小鼠模型研究HSC衰老的关键分子信号通路及其调控机制。具体的研究目标包括：

1. 在端粒缩短或者ROS升高情况下，研究HSC的自我更新和稳态维持的调控网络；

2. 探讨衰老和损伤应激状态下，HSC中内源性ROS产生机制及其对HSC自我更新能力的影响； 研究内容:

1、在端粒缩短或者ROS升高情况下，研究GADD45a基因对HSC衰老的调控。G3 Terc-/-小鼠HSC的衰老主要是由于端粒依赖的p53途径，而ATM-/-小鼠HSC的衰老主要是由于端粒非依赖的p38途径。在不同损伤应激情况下，GADD45a基因参与p53或者p38介导的基因调控网络。我们将通过建立Terc和GADD45a双基因敲除小鼠，以及ATM和GADD45a双基因敲除小鼠，分别研究端粒缩短或者ROS升高导致的HSC衰老过程中GADD45a基因的作用。具体研究内容如下：

（1） 通过杂交的方式，建立两种双基因敲除小鼠品系。其中，Terc和GADD45a双基因敲除小鼠需要通过连续杂交方式，产生第三代的Terc和GADD45a双基因敲除小鼠（G3 Terc-/- GADD45a-/-）。

（2） 建立并维持Terc+/+ GADD45a+/+，G3 Terc-/- GADD45a+/+，Terc+/+ GADD45a-/-，G3 Terc-/- GADD45a-/-四种基因型的小鼠种群；建立并维持

ATM+/+ GADD45a+/+，ATM-/- GADD45a+/+，ATM+/+ GADD45a-/-，ATM-/- GADD45a-/-四种基因型的小鼠种群。

（3） 记录小鼠的体重、活动能力、外周血计数和生存时间，分析各种基因型小鼠的生存曲线。

（4） 通过流式细胞术分析各种基因型小鼠造血系统的衰老表现以及造血干细胞的稳态维持。 （5） 通过竞争性HSC

移植实验，分析各种基因型小鼠HSC自我更新能力和分化潜能的改变。 （6） 将野生型小鼠HSC移植入各种基因型小鼠体内，研究干细胞环境的改变对正常HSC自我更新能力和分化潜能的影响。

2、探讨衰老及应激状态下HSC中ROS产生机制及其对HSC自我更新能力的影响，阐明HSC细胞衰老的氧化损伤机制。具体研究内容如下：

（1） 利用端粒酶、ATM缺失小鼠，观察老年小鼠HSC中ROS升高是否伴随有NOX4的高表达。利用NOX4抑制剂或RNA干扰技术抑制NOX4表达对老年小鼠HSC的自我更新能力及ROS升高是否具有改善作用。

（2） 利用端粒酶、ATM缺失小鼠在DNA损伤应激刺激时（不同剂量全身照射及DNA损伤诱导剂），HSC中NOX4表达及与HSC功能改变的关系。 （3） 利用NOX4缺陷小鼠与端粒酶缺陷小鼠或ATM缺陷小鼠双敲除，进一步探讨NOX4产生的ROS在HSC衰老中的意义。

（4） 分析测定老年小鼠及氧应激暴露小鼠（照射或DNA损伤药物）HSC中DNA双链断裂损伤及由ROS诱导的DNA损伤产物羟基-2’脱氧鸟嘌呤核苷(8-OH-dG)含量与HSC功能损伤的关系。

（5） 利用不同模式动物的模型以及通路蛋白抑制剂阐明ATM等DNA反应蛋白对NOX来源的ROS的调节作用。

（6） 利用不同模式动物的模型以及通路蛋白抑制剂阐明NOX来源的ROS对HSC细胞周期调控的影响包括与p53/p21、p38/p16信号通路蛋白调节的相关关系。

经费比例: 24%

承担单位: 中国医学科学院实验动物研究所 中国医学科学院血液病医院（血液

百度搜索“70edu”或“70教育网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，70教育网，提供经典教育范文2024CB964800-G造血干细胞维持、衰老与再生的调控机制研究 - 图(3)在线全文阅读。