2024CB964800-G造血干细胞维持、衰老与再生的调控机制研究 - 图(6)

四、年度计划

2011年度 1、研究内容

（1）利用流式细胞术分析在Puma、iASPP基因敲除的小鼠模型中，幼鼠、成年鼠及衰老小鼠HSC的免疫表型及数目、HSC的细胞周期及CKI蛋白的表达情况利用realt ime-PCR及western blot分别在RNA及蛋白水平检测幼鼠、成年鼠及衰老小鼠的p18/p21的比例及p16 p19的水平。

（2）建立两种双基因敲除小鼠品系。Terc和GADD45a双基因敲除小鼠需要通过连续传代的方式，产生第三代的Terc和GADD45a双基因敲除小鼠（G3 Terc-/- GADD45a-/-）。建立并维持Terc+/+ GADD45a+/+，G3 Terc-/- GADD45a+/+，Terc+/+ GADD45a-/-，G3 Terc-/- GADD45a-/-四种基因型的小鼠的研究队列。建立并维持ATM+/+ GADD45a+/+，ATM-/- GADD45a+/+，ATM+/+ GADD45a-/-，ATM-/- GADD45a-/-四种基因型的小鼠的研究队列。

（3）完成对ENU (N-乙基-N-硝基脲)化学诱变处理后的斑马鱼F2代突变遗传家系800个的收集工作和大约10万份全胚胎原位杂交筛选；

（4）应用改进的成体和新生小鼠HSC移植模型、T/B淋巴细胞体外诱导分化等方法综合分析胚内（除p-Sp/AGM区外）的造血活性分布特点；考察若干表面标志基因在AGM区HSC发育过程中的动态变化，明确其在不同发育时间点和不同造血组织（卵黄囊、胎盘、胎肝、骨髓等）的表达特征；研制内皮特异性Tbr2和Smad4基因剔除小鼠；完善小鼠胚胎发育中期生血内皮数量功能检测的技术手段；对上述条件基因剔除小鼠的生血内皮和定向造血体外发育潜能进行检测；利用小鼠基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得Endomucin、EphB4等系列特异性分子标记物的启动子；研制相关启动子控制的Cre转基因载体；

（5）分选获得不同年龄段人HSC，并利用SCF等细胞因子进行培养、扩增，结合前几个部分的研究内容，分析不同来源的HSC中p53,p16通路中关键因子表达以及DNA甲基化等表达遗传学特征。与此同时，建立HSC重编程为iPS细胞的技术平台。 2、预期目标

（1）明确Puma、iASPP基因缺失后，HSC的免疫表型及数目、HSC的细胞周期及CKI蛋白的表达情况的变化。明确不同年龄小鼠的p18/p21的比例及p16 p19的表达水平。

（2）获得足够数量的用于衰老研究的实验小鼠队列，包括Terc+/+ GADD45a+/+，G3 Terc-/- GADD45a+/+，Terc+/+ GADD45a-/-，G3 Terc-/- GADD45a-/-四种基因型的小鼠，以及ATM+/+ GADD45a+/+，ATM-/- GADD45a+/+，ATM+/+ GADD45a-/-，ATM-/- GADD45a-/-四种基因型的小鼠的研究队列。

（3）获得至少三种类型的HSC突变株： HSC增多、减少、迁移和分布异常；初步发现1-2个造血发育的新位点；明确1-2个HSC发育的特征性新标志；明确内皮特异性Tbr2和Smad4基因剔除小鼠生血内皮数量和内皮生血体外功能是否异常；研制获得2-3种特定内皮细胞分子标志的启动子驱动的Cre转基因载体； （4）分离不同年龄阶段的HSC，分析其表观遗传学特征 2012年度 1、研究内容

（1）利用Puma基因敲除的小鼠模型，通过竞争性骨髓移植实验方法分析Puma缺失对不同年龄阶段的小鼠HSC的功能，特别是自我更新的能力的影响。分离ATF-4-/-小鼠的HSC后，研究HSC/HPC细胞周期的特点，并从细胞周期调控蛋白的水平、功能等方面研究该模型HSC细胞周期调控的机制与特点。建立骨髓MSC数量减少或功能缺失的动物模型。

（2）继续建立并维持用于衰老研究的实验小鼠队列。记录各种基因型小鼠的体重、活动能力、外周血计数和生存时间，分析各种基因型小鼠的生存曲线。通过流式细胞术分析各种基因型小鼠造血系统的衰老表现以及造血干细胞的稳态维持。利用端粒酶、ATM缺失小鼠，观察老年小鼠HSC中ROS升高是否伴随有NOX4的高表达。

（3）对所获得的斑马鱼HSC突变株进行证实，并进行全基因组扫描和步移、定位克隆突变基因，使用Morpholino knock-down技术和Rescue技术进一步证实该突变基因为候选基因；基于上述发现的新的造血位点，通过体外器官培养、诱导后移植、Ncx-1基因敲除小鼠等进一步明确其造血潜能是否原位发生；分析Rictor/mTOR、p53通路相关分子、不同CKI等基因敲除小鼠的胚胎中定向造血

发育的表型；深入内皮特异性Tbr2和Smad4基因剔除小鼠内皮生血功能的研究，尤其是通过移植重建实验考察其造血干细胞前体的数量和功能；通过显微注射构建Cre转基因小鼠；利用PCR和Southern杂交筛选携带外源基因的转基因首建者小鼠。传代保种获得更多数量的转基因小鼠；

（4）诱导HSC形成iPS细胞。观察不同来源细胞所形成iPS细胞的能力是否有差异。研究不同年龄阶段的端粒酶敲除小鼠或者ATM基因敲除小鼠的鼠尾成纤维细胞（TTFs）或者HSC在体外诱导生成iPS细胞的效率。 2、预期目标

（1）明确Puma基因缺失后不同年龄阶段的小鼠HSC的功能，特别是自我更新的能力的变化。明确ATF-4基因缺失后，小鼠的HSC/HPC细胞周期的特点与调控机制。建立骨髓MSC数量减少或功能缺失的动物模型。

（2）在建立并维持用于衰老研究的实验小鼠队列的基础上，对各种基因型小鼠在衰老过程中的各种表型进行初步分析，获得各个组织器官衰老的基本数据，尤其是造血系统衰老的各种具备数据，为进一步研究HSC的功能奠定实验基础。 (3) 初步获得4-6个与斑马鱼HSC的发育过程相关的基因；完整、深入认识新的HSC发育位点的特征；阐明1-2个基因对小鼠AGM区HSC发育的调控作用；明确内皮特异性Tbr2和Smad4基因剔除小鼠生血内皮体内的造血重建潜能；构建1-2种特定内皮细胞群体表达的Cre转基因小鼠； (4) 分析不同年龄段HSC重编程为iPS细胞效率 2013年度 1、研究内容

（1）分离Puma基因敲除小鼠的HSC，在体外利用单细胞培养实验对HSC的增值动力学及分化潜能进行分析。iASPP在HSC自我更新、多向分化和增殖中的作用。利用体外HSC的长周期培养、单细胞培养实验及体内重建造血实验、骨髓竞争移植实验等评价ATF-4-/-小鼠的HSC及其干细胞巢的功能。利用体外HSC的长周期培养、单细胞培养实验及体内重建造血实验、骨髓竞争移植实验等评价p18-/-或p21-/-的幼鼠、成年鼠及衰老小鼠的HSC及其干细胞巢的功能。

（2）通过竞争性HSC移植实验，分析各种基因型小鼠HSC自我更新能力和分化潜能的改变。将野生型小鼠HSC移植入各种基因型小鼠体内，研究干细胞环境的

改变对正常HSC自我更新能力和分化潜能的影响。利用NOX4抑制剂或RNA干扰技术抑制NOX4表达对老年小鼠HSC的自我更新能力及ROS升高是否具有改善作用。分析测定老年小鼠及氧应激暴露小鼠（照射或DNA损伤药物）HSC中DNA双链断裂损伤及由ROS诱导的DNA损伤产物羟基-2’脱氧鸟嘌呤核苷(8-OH-dG)含量与HSC功能损伤的关系。

（3）斑马鱼HSC突变基因和所累积信号转导路径的功能研究；明确AGM区血液血管干细胞（BL-CFC）的表面分子特征；结合上述结果，流式多参数分选小鼠E10.5胚胎AGM区单细胞（如：Flk-1+CD34+c-Kit+）单孔接种后分析血管和HSC功能；构建Flk-1 p/e GFP报告载体，制备稳定转染Flk-1 p/e GFP的内皮细胞系（无生血功能），通过cDNA表达文库和RNAi文库转染获得GFP－细胞克隆（候选的生血内皮细胞）；或者制备转基因小鼠，分选AGM区PECAM-1+GFP－（生血内皮）和PECAM-1+GFP+（非生血内皮）细胞，进行功能基因组生物芯片比较分析；对上述生血内皮数量功能缺陷的Smads信号通路分子缺失的小鼠，进行生血内皮调控的分子机制研究；对前期研制的Cre转基因小鼠与报告基因小鼠ROSA26交配，利用LacZ染色、流式细胞FDG分选等方式对Cre转基因在胚胎不同发育时间的表达、胚胎和成体各造血位点表达的组织特异性以及贡献进行鉴定分析。 （4）建立诱导iPS细胞向HSC/HPC分化的体系，然后对诱导获得的造血干/祖细胞进行分选富集与鉴定。并在此基础上特异性诱导造血干/祖细胞定向分化为红系细胞，对诱导分化的红系细胞的表型和功能进行检测。 2、预期目标

（1）明确Puma基因缺失后，小鼠的HSC的增值动力学及分化潜能变化特点。明确iASPP基因在HSC自我更新、多向分化和增殖中的作用。明确ATF-4基因对小鼠的HSC及其干细胞巢功能的影响。明确p18及p21对不同年龄小鼠的HSC及其干细胞巢功能的影响。

（2）在前期实验的基础上，主要分析和研究HSC的自我更新能力和分化潜能在自然衰老和应激损伤过程中的变化。通过骨髓移植实验，明确造血干细胞环境的改变对正常HSC的自我更新能力和分化潜能的影响。

（3）识别2－4个对斑马鱼HSC的发育、迁移和自我更新有重要调控作用的基因；阐明血液血管干细胞产生HSC的潜能；筛选获得候选的HSC发育的调节基因；初

步阐明Smads信号通路调节生血内皮特化的分子机制；利用构建的Cre转基因小鼠的造血谱系示踪揭示生血内皮新的分子特征； （4）iPS细胞向HSC定向诱导分化 2014年度 1、研究内容

（1）构建逆转录病毒载体，采取干扰的方法降低正常干细胞Puma基因的表达水平，再进行HSC连续移植实验，观察对HSC移植率的影响。采取竞争移植方法观察降低Puma基因表达对重建造血的影响。用基因芯片比较ATF-4-/-小鼠和正常小鼠HSC基因表达的差异，并用实时定量PCR加以验证。根据实验得到的结果，选择1－2个目的基因进行干预，观察对HSC数目及功能的影响。用基因芯片技术对不同CKI单基因及双基因敲除模型的幼鼠、成年鼠及衰老小鼠的基因表达水平进行分析。研究MSC数量减少或功能缺失导致的HSC以及成熟血细胞的变化。 （2）利用单个HSC体外克隆实验，分析各种基因型小鼠HSC增殖动力学、自我更新能力维持和分化潜能的改变。利用不同模式动物的模型以及通路蛋白抑制剂阐明端粒缺陷及NOX来源的ROS对HSC细胞周期调控的影响包括与p53/p21、 p38/p16信号通路蛋白调节的相关关。利用端粒酶、ATM缺失小鼠在DNA损伤应激刺激时（不同剂量全身照射及DNA损伤诱导剂），HSC中NOX4表达及与HSC功能改变的关系。利用NOX4缺陷小鼠与端粒酶缺陷小鼠或ATM缺陷小鼠双敲除，进一步探讨NOX4产生的ROS在HSC衰老中的意义。

（3）评估该突变基因和所累积的信号转导路径在人类HSC发育和白血病肿瘤干细胞转化中的地位和作用；利用基因剔除小鼠在血液血管干细胞水平研究Smads信号分子（Smad2, Smad3, Smad4, Smad5等）的造血是否异常；利用我们新研制的Cre转基因小鼠验证之前利用Tie2-Cre转基因小鼠获得的Smads信号条件剔除小鼠生血内皮缺陷的功能结果；选取前述斑马鱼和小鼠模型筛选的5-8个候选基因，制备基因过表达和敲减载体，分别感染小鼠胚胎干细胞和胚胎AGM区细胞，以评价该基因在小鼠胚胎造血发育中的意义；若需要，可制备基因敲除小鼠作更详细分析。

（4）探讨p53、p16等遗传学因素和DNA甲基化等表观遗传学因素在iPS细胞生成和分化中的作用和调控机制，并筛选鉴定不同衰老程度的HSC中可能影响iPS

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