代谢组学方法与应用（许国旺）张强(2)

生物的代谢组学、代谢工程”学术 研讨会。2004年10月10~11日在上海威斯汀大饭店，中国科学院大连化学物理研究 所和美国Waters公司合作举办的代谢组学高层研讨会及技术报告会隆重举行，英国伦敦帝国理工学院的Jeremy Nicholson教授受邀首次访问中国。此次研讨会的成功召开，进一步拉近了中国代谢组学与国际的距离，也标志着中国科学院大连化学物理研究所和美国Waters公司“代谢组学联合实验室”的正式运行。2004年11月，中国科学院启 动了知识创新方向性项目“植物、微生物代谢组学的初步研究”。2004年12月18日， 天津药物研究院与天津大学共同主办的“代谢物组学与药物研究高层研讨会”在天津大学化工学院举行，就“代谢物组学与重大疾病药物治疗相关基础和应用研究”进行了深入探讨。2005年4月5~6日，Waters公司首届制药技术论坛在上海虹桥宾馆召开， Jeremy Nicholson教授和许国旺研究员等做了关于代谢组学、新药发现和研究等方面的报告，探寻代谢组学脉动对制药业的深层影响及其对中草药开发方向的揭示[19]。在这期间，国内众多科研机构也纷纷加入代谢组学研究的行列。2005年，许国旺受Springer Link邀请，正式成为Metabolomics杂志编委。在“大连化学物理研究所科学论坛 （DICP SYMPOSIUM）专项基金”资助下，中国科学院大连化学物理研究所分别在 2005年4月和2006年9月组织了“现代分离/分析化学和代谢组学”和“分析生物化学和中医药代谢组学”科学论坛，邀请了数十位来自英国、美国、德国、荷兰、日本、 比利时、中国、中国香港、中国澳门等国家和地区的著名专家和学者参加。在国家有关部门和单位的配合下，2006年9月13~14日在中国科学院大连化学物理研究所召开了为期2天的主题为“医学代谢组学”的第284次香山科学会议，国内数家相关研究机构、大专院校和国外多个从事代谢组学研究的团体近50余位专家学者应邀出席。由中国工程院医药卫生学部等主办的2007年“环渤海医药发展前沿论坛”暨“代谢组学与中药研究”调研汇报会于2007年12月21~22日在天津举行，在刘昌孝、张伯礼和杨胜利三位院士的组织下，中药代谢组学研究的部分优势单位（中国科学院大连化学物理 研究所、天津药物研究院、上海交通大学、中国药科大学、浙江大学、中国科学院武汉 物理与数学研究所、天津中医药大学、沈阳药科大学等）的专家就代谢组学的技术平台、生物信息学、中药安全性、中药资源和质量、中药方剂作用机制和中药作用物质基础等报告最新的研究进展。所

有这些学术研讨会，一方面提供了与国内外一流科学家交流的机会，另一方面也使得我国的研究队伍不断扩大和加强。

1.1.2.2 代谢组学在各国的科研战略上得到了重视

美国Global Information Inc. 的市场调查报告显示，2002~2007年代谢组学技

术 工业的市场年增长率将达到46%[20]。2003年，美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）在其中长期发展规划 （NIH Roadmap）中[21]，设立代谢组学专题，提出了要建立专门收集小分子信息并从事高通量筛选的研究中心，发展代谢组学技术平台，更快、更多地发现具有生物活性的小分子的构想。其下属的The National Institute of General Medical Sciences已在2003年批给加州大学3500万美元的一个5年计划做鼠巨噬细胞的类脂组学（lipidomics）研究。与此类似，日本政府也专门设立了“Construction of Basic Techniques for Lipidomics and Their Application” 国家项目，建立类脂的代谢途径数据库。2005年1月，加拿大启动7 “人类代谢组项目”（http://www. metabolomics. ca/），希望从组织和体液中识别、定量和分离出浓度大于1μmol/L 的所有代谢物。到2006年底，已定性出800个代谢产物。预期有1400个代谢产物可被定性、定量，其信息可放到公共数据库中，并可制备出单体保存到一80℃的冰箱中。至2008年1月5日，该项目已从数千种书籍、杂志文献和电子数据库中收集了2500个内源性代谢产物，建立了人类代谢组数据库（http://www.hmdb. ca/）[22]。库中每种代谢产物都有其相应的化学、临床、分子生物学和生化数据，据说是目前世界上最全的关于人类代谢物和人类代谢的数据库。

我国政府也十分重视代谢组学的研究，科技部早在2003年就将代谢组学平

台技术的建立列入了国家“863”计划，并交给大连化学物理研究所所承担。在“十一五”期间，科技部先后在国家重大研究计划“蛋白质科学”、国家重点基础研究发展规划 （“973”）、国家高技术研究发展计划（“863”计划）和“十一五”科技支撑项目、食品 安全等方面支持了代谢组学的研究。国家自然科学基金委员会化学科学部连续多年将 “组学分析中的新原理、新方法和新技术”列为重点项目支持方向。

代谢组学有着巨大的理论价值和应用前景，企业界对此也非常关注，西方国

家先后成立了多个关于代谢组学研究的研究中心或公司，如德国

MAX-PLANCK-INSTITUT 的分子植物生理所、英国的Metabometrix Ltd、荷兰的Platform Plant Metabolomics（PPM）、美国的 The Metabolomics Group、加拿大的Phenomenome Discoveries Inc. 等。PFIZER等六个大制药公司与英国帝国理工学院的科学家们一起组织了一个为期3年的关于药物毒性研究的研究小组（COMET 1），拟在药物的发现（discovery）到开发（development）阶段用代谢组学的方法来评价药物的毒性（详见第13章）。在第一期取 得成功的基础上，第二期项目（COMET 2）也于2006年3月正式启动，目标是研究标准毒物的分子机制，进而建立具预测性的构效关系专家系统。

以代谢组学为核心的系统生物学技术建立的BG MEDICINE公司（http://www.

bg-medicine.com/），非常重视代谢标志物对疾病的新诊断方法，在发现肺结核疾病的生物标志物方面处于领先地位。正在与M. D. Anderson Cancer Center合作以识别新的、专一性好的、敏感的用于监测乳腺癌患者治疗效果的血中蛋白质和小分子标志物。并从ACS Biomarker B. V获得授权来开发和商品化基于生物标志物的分子诊断测试方法以预兆充血性心力衰竭（congestive heart failure）。与 Multiple Sclerosis Research Center of New York （MSRCNY）合作以发现针对疾病和市场上现有药物疗效、安全性的新标 志物。正在与FDA及7个制药公司合作以发现肝毒的生物标志物。

Metabolon 与美国传染病军队医学研究所（U.S. Army Medical Research

Institute of Infectious Diseases，USAMRIID）签署协议[23]，军队将使用Metabolon 的代谢组学技术平台来研究接种AVA炭疽热疫苗（anthrax vaccine）的人的生化轮廓（biochemical profile）。 AVA 疫苗是 FDA 许可的唯一接种人的炭疽热疫苗。 这也是第一个对接种疫苗的人的大规模代谢组学研究，这种生化轮廓将帮助USAMRIID较好地了解疫苗的安全性、有效性及其作用机制。

所有这些说明，代谢组学得到了学术界、政府和工业界的极大重视。

1.1.3 代谢组学与系统生物学

在几种常见的组学研究中，基因组学主要研究生物系统的基因结构组成，即

DNA的序列及表达。蛋白质组学研究由生物系统表达的蛋白质及由外部刺激引起的差异。代谢组学是研究生物体系（细胞、组织或生物体）受外部刺激所产生的所有代谢产物的变化，可以认为代谢组学是基因组学和蛋白质组学的延伸。随

着这些组学研究的深入，科学家们逐渐认识到：基因组的变化不一定能够得到表达，从而并不对系统产生实质影响。某些蛋白质的浓度会由于外部条件的变化而升高，但由于这个蛋白质可能不具备活性，从而也不对系统产生影响。同时，由于基因或蛋白质的功能补偿作用，某个基因或蛋白质的缺失会由于其他基因或蛋白质的存在而得到补偿，最后反应的净结果为零。而小分子的产生和代谢才是这一系列事件的最终结果，它能够更准确地反映生物体系的状态[24]。因此，系统生物学的研究应涵盖基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，任何单一组学的研究对生物问题的理解都是不全面的。

系统生物学是在细胞、组织、器官和生物体整体水平研究结构和功能各异的

各种分子及其相互作用，并通过计算生物学来定量描述和预测生物功能、表型和行为的科学[25~28]。系统生物学从基因组序列开始，完成从生命密码到生命过程的研究。如果将生命体看成一个在基因调控下的无数的相互关联的生化反应所组成的一个新陈代谢网络，那么系统生物学将要鉴别每一个反应节点的各种分子及其相互作用，从局部到整体，最终完成整个生命活动的路线图。系统生物学的主要技术平台为基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、相互作用组学和表型组学等，这些“组学”分别在DNA、mRNA、蛋白质和代谢产物水平检测和鉴别各种分子并研究其功能以及各种分子之间的相互关系。进而发现生化反应的途径和网络，构建生物学模块，并在研究模块相互作用的基础上绘制生物体的相互作用图谱。代谢组学与其他组学结合对阐明生命的奥秘具有重要意义。

1.2代谢组学的研究方法

代谢组学研究一般包括样品采集和制备、代谢组数据的采集、数据预处理、多变量数据分析、标志物识别和途径分析等步骤（图1-5）[29]。生物样品可以是尿液、血液、组织、细胞和培养液等，采集后首先进行生物反应灭活、预处理，然后运用核磁共振、质谱或色谱等检测其中代谢物的种类、含量、状态及其变化，得到代谢轮廓或代谢指纹。而后使用多变量数据分析方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘，识别出有显著变化的代谢标志物，并研究所涉及的代谢途径和变化规律，以阐述生物体对相应刺激的响应机制，达到分型和发现生物标志物的目的[29,30]。

根据研究的对象和目的不同，Oliver Fiehn将对生物体系的代谢产物分析分为

四个层次[12]。

（1）代谢物耙标分析（metabolite target analysis）：对某个或某几个特定组

分的分析。在这个层次中，需要采取一定的预处理技术，除掉干扰物，以提高检测的灵敏度。

（2）代谢轮廓分析（metabolic profiling analysis）：对少数所预设的一些代

谢产物的定量分析。如某一类结构、性质相关的化合物（如氨基酸、顺二醇类）、某一代谢途径的所有中间产物或多条代谢途径的标志性组分。进行代谢轮廓分析时，可以充分利用这一类化合物的特有的理化性质，在样品的预处理和检测过程中，采用特定的技术来完成。

（3）代谢组学（metabonomics，metabolomics）：限定条件下特定生物样品

中所有内源性代谢组分的定性和定量。进行代谢组学研究时，样品的预处理和检测技术必须满足对所有的代谢组分具有高灵敏度、高选择性、高通量的要求，而且基体干扰要小。代谢组学涉及的数据量非常大，因此需要有能对其数据进行解析的化学计量学技术。

（4）代谢指纹分析（metabolic fingerprinting analysis）：不具体鉴定单一组

分，而是通过比较代谢物指纹图谱的差异对样品进行快速分类（如表型的快速鉴定）。

严格地说，只有第三层次才是真正意义上的代谢组学研究。目前，代谢组学

的最终目标还是不可完成的任务，因为还没有发展出一种真正的代谢组学技术可以涵盖所有的代谢物而不管分子的大小和性质。但是，它和代谢轮廓（谱）分析有着显著的差别，在具体的实验中，代谢组学研究会设法解析所有的可见峰，因此代谢组学研究的特征也可以表述为它会设法分析尽可能多的代谢组分。

1.2.1样品米集与制备

样品的采集与制备是代谢组学研究的初始步骤也是最重要的步骤之一，代谢

组学研究要求严格的实验设计。首先需要采集足够数量的代表性样本，减少生物样品个体差异对分析结果的影响。实验设计中对样品收集的时间、部位、种类、样本群体等应给予充分考虑。在研究人类样本时，还需考虑饮食、性别、年龄、昼夜和地域等诸多因素的影响。此外，在分析过程中要有严格的质量控制，需要

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