试验一黄柏中小檗碱的提取分离和鉴别

天然药物化学实验讲义

重庆医科大学药学院

目 录

一、黄柏中生物碱的提取、分离和鉴别 二、槐米中芦丁、槲皮素的提取、分离与鉴别 三、穿心莲中穿心莲内酯的提取、分离与鉴别 四、八角茴香挥发油的提取及鉴别 五、大黄中蒽醌苷元的提取、分离与鉴别 六、苦参生物碱的提取、分离与鉴别

前 言

《天然药物化学实验》是一门实践性很强的课程，理论教学与实验教学是一个不可分割的完整体系。通过实验课的学习使学生能印证并加深理解课堂讲授的理论知识，掌握由天然药物中提取、分离、精制有效成分，并对其进行鉴别的基本方法和技能，提高学生独立动手、观察分析、解决问题的能力，培养学生严谨的科学态度和良好的科研作风。

实验一 黄柏中小檗碱的提取、分离和鉴别

【实验目的】

1.掌握从黄柏中提取小檗碱的原理和方法。 2.掌握小檗碱的理化性质和鉴别方法

3.熟TLC的基本操作以及在中药有效成分提取分离中的应用。

【实验原理】

OON+1.小檗碱(berberine)，含量为1.4%-4%(川黄柏含量较高) 性状：黄色结晶，有5.5个结晶水，mp145℃。

OMeOMe溶解性：能缓缓溶于冷水中（1:20），微溶于冷乙醇（1:100），易溶于热水和熱乙醇，微溶或不溶于苯、氯仿和丙酮，硝酸盐极难溶于水，盐酸盐微溶于冷水（1:500）但较易溶于沸水，硫酸盐和枸橼酸盐在水中溶解度较大（1:30），盐酸小檗碱为黄色结晶，含2分子结晶水，220℃时分解并转变为棕红色小檗红碱，285℃时完全熔融。

2.小檗碱为季铵碱，其游离型在水中溶解度较大，其盐酸盐在水中溶解度较小。利用小檗碱的溶解性及黄柏中含黏液质的特点，首先用石灰乳沉淀黏液质，用碱水提出小檗碱，再加盐酸使其转化为盐酸小檗碱沉淀析出。

【实验仪器与试剂】

1.1000、500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，电炉，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，纱布，脱脂棉。

2.川黄柏粗粉，滤纸，pH试纸，生石灰，1%硫酸，浓硫酸，浓盐酸，浓硝酸，次氯酸钠，10%氢氧化钠，丙酮，乙醇，稀硫酸，锌粒，食盐，薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，展开剂：苯－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－水（6:3:1.5:1.5:0.3），甲醇，氨水，盐酸小檗碱对照品。

【实验步骤】

1.提取 称取黄柏粗粉200g，加入1%硫酸600mL，搅拌均匀，浸泡过夜，纱布过滤。或称取黄柏粗粉200g，加入1%硫酸200mL，搅拌均匀，使湿润度合适，放置30min后，装

入渗漉筒内，用1%硫酸浸泡过夜，渗漉，速度以5～6mL/min为宜。收集渗漉液500～600mL即可停止渗漉。

2.取上项提取液，加入石灰乳调pH11～12,静置沉淀，脱脂棉滤过，滤液用浓盐酸调pH2～3，再加入溶液量10%食盐，搅拌使溶解，溶液静置过夜，析晶，滤取结晶，得盐酸小檗碱粗品。

3.精制 将盐酸小檗碱粗品放入25倍量沸水中，于水浴上加热使溶解，趁热滤过，滤液加浓HCI调pH2左右，静置过夜，滤取结晶，80℃以下干燥，得精制盐酸小檗碱。

4.盐酸小檗碱的鉴别

（1）取盐酸小檗碱少许，加漂白粉（或次氯酸钠）少许，即显樱红色。

（2）取盐酸小檗碱少许，加稀硫酸2mL使溶解，加浓硝酸1～2滴，即显樱红色。 （3）取盐酸小檗碱约0.05g，溶于5mL热水中，加入10%NaOH溶液2mL，显橙色。溶液放冷，加入丙酮约0.5mL，放置，有黄色丙酮小檗碱结晶析出。

（4）取盐酸小檗碱少许，加水2mL溶解后，加锌粉少许，再分数次加入浓硫酸数滴，振摇，每隔10min加一次，观察其黄色是否消退。

（5）薄层色谱鉴别

吸附剂：硅胶H-CMC-Na板。

展开剂：苯－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－水（6:3:1.5:1.5:0.3），氨蒸气预平衡10min后展开。

样品液：自制盐酸小檗碱甲醇液（每1mL含0.5mg）。 对照品液：盐酸小檗碱对照品甲醇液（每1mL含0.5mg）。 显色：置紫外灯（365nm）下检视，显黄色荧光斑点。 结果：记录样品斑点和对照品斑点的颜色和位置，计算Rf值。

【基本操作注意事项】

1.实验原料尽可能选用小檗碱含量较高的川黄柏，或小檗碱含量较低的关黄柏，后者粘液质较多过滤麻烦。

2.加入氯化钠的目的是将小檗碱转化成盐酸小檗碱并利用其盐析作用，降低其在水中的溶解度。其用量不宜过少，否则盐析效果不好，收率过低。

3.在精制盐酸小檗碱时，因为盐酸小檗碱几乎不溶于冷水，放冷易析出结晶，所以水浴加热溶解后，要趁热滤过，防止盐酸小檗碱在滤过时析出结晶，使滤过困难，产量降低。

【思考题】

1.怎样从黄柏中提取分离盐酸小檗碱？原理是什么？为什么加石灰乳？ 2.通过从黄柏中提取盐酸小檗碱，试述药材粉碎度等对提取的影响。

3.用薄层色谱法检识盐酸小檗碱时，选用氧化铝或硅胶作吸附剂，二者有何区别？展开剂有何不同？

实验二 槐米中芦丁、槲皮素的提取、分离与鉴别

【实验目的】

1.掌握黄酮类化合物的提取原理和方法。 2.掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法。 3.熟悉和了解采收与炮制对芦丁含量的影响。

【实验原理】

1.槐花为豆科植物槐Sophora japonica L．的干燥花及花莆。前者习称槐花Flos Sphorae；后者习称槐米Flos Sophorae Immaturus。主产于河北、山东、河南、陕西、江苏、广东、广西、辽宁等地。以河北、山东、河南产量大。 性能：苦，性微寒。功效：凉血止血、清肝泻火 。应用：用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕等。

2.主要含有芦丁（芸香苷）、槲皮素，还含少量皂苷类及多糖、粘液质等。近代研究表明槐米含芦丁可高达23.5%，槐花开放后降至13.0%。芦丁可用于治疗毛细血管脆性引起的出血症，并用作高血压辅助治疗剂。芦丁还可以作为制备槲皮素、羟乙基槲皮素、羟乙基芦丁、二乙胺基乙基芦丁等的原料。

3.芦丁为浅黄色粉末或极细微淡黄色针状结晶，含3分子结晶水（C27H30O16·3H2O），加热至185℃以上熔融并开始分解。芦丁的溶解度，在冷水中1:10000，沸水中1:200，沸乙醇中1:60，沸甲醇中1:7，可溶于乙醇、吡啶、甲酰胺、甘油、丙酮、冰醋酸、乙酸乙酯中，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚。芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液中，酸化后又可析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁。

【实验仪器与试剂】

1.1000、500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，电炉，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，色谱专用滤纸，聚酰胺色谱膜，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，纱布，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机。

2.槐花米粗粉，滤纸，pH试纸，生石灰，硼砂，2%硫酸，浓硫酸，稀盐酸，浓盐酸，10%氢氧化钠，乙醇，10%α-萘酚乙醇溶液，镁粉，1%醋酸镁甲醇溶液，1%三氯化铝乙醇溶液，2%二氯氧锆甲醇溶液，2%枸橼酸甲醇溶液，Ba(OH)2，滑石粉，甲醇，氨水，芸香苷、槲皮素、葡萄糖、鼠李糖对照品，展开剂：正丁醇-乙酸-水（4:1:5）上层溶液（纸色谱），90%乙醇或乙醇-水（7:3）（聚酰胺色谱），显色：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂。

【实验步骤】

1.芸香苷的提取 称取50g槐花米粗粉，于500mL烧杯中，加入0.4%硼砂沸水溶液300mL，在搅拌下小心加入石灰乳调至pH8～9，加热微沸30min，注意添加水，随时补充蒸发掉的水分保持原体积并维持pH8～9，趁热用脱脂棉过滤；药渣同样操作再提取一次，合并滤液，稍冷，用浓盐酸调至pH4～5，静置过夜使沉淀完全，抽滤，用蒸馏水洗3～4次，抽干置空气中自然干燥得淡黄色粗制芸香苷。

2.芸香苷的精制 将芸香苷粗品置500mL烧杯中，加适量（约100mL）蒸馏水，再用石灰水调至pH8。加热煮沸数分钟，使充分溶解。趁热抽滤，滤液滴加3mol/LHCl调至pH7，放置18h以上，即析出沉淀。减压过滤，用少量蒸馏水洗涤沉淀2～3次。抽干，于70～80℃干燥1h，即得精制芦丁。称重，计算产率。

3.芸香苷的水解 取精制芦丁2g，研细，置于500mL圆底烧瓶中，加2%硫酸溶液150mL，于直火回流30min，放置至室温，析出黄色槲皮素结晶，抽滤，滤液保留作糖部分的鉴定。沉淀水洗后再用95%乙醇重结晶一次，得黄色针状结晶，于70～80℃以下干燥，即得精制槲皮素。

4.检识

（1）取芸香苷、槲皮素少许，分别用10mL乙醇溶解，制成试样溶液，照以下方法进行实验。

①Molish反应：取试样溶液各2mL，分置于两支试管中，加10%α-萘酚乙醇溶液1mL，振摇后倾斜试管45°，沿管壁滴加2mL浓硫酸，静置，观察两液面交界处颜色变化（棕色环）。

②盐酸-镁粉反应：取试样溶液各2mL，分别置于两支试管中，各加入镁粉少许，再加入浓盐酸数滴，观察并记录颜色变化。

③醋酸镁反应：取两张滤纸条，分别滴加试样溶液后，加1%醋酸镁甲醇溶液2滴，于紫外灯下观察荧光变化，并记录。

④三氯化铝反应：取两张滤纸条，分别滴加试样溶液后，加1%三氯化铝乙醇溶液2滴，

于紫外灯下观察荧光变化，并记录。

⑤锆-枸橼酸反应：取试样溶液各2mL，分别置于两支试管中，各加2%二氯氧锆甲醇溶液3～4滴，观察颜色，然后加入2%枸橼酸甲醇溶液3～4滴，观察并记录颜色变化。

（2）糖的纸色谱鉴定 取水解母液20mL，用Ba(OH)2的细粉（约2.6g）中和至pH7，滤去生成的BaSO4沉淀（可用滑石粉助滤），滤液浓缩至约1mL，供纸色谱点样用。

样品：水解浓缩液 色谱滤纸：新华滤纸

对照品：葡萄糖、鼠李糖水溶液

展开剂：正丁醇-乙酸-水（4:1:5）上层溶液。

显色：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂，喷后105℃烘10min，显棕红色斑点。苯胺-邻苯二甲酸的配制：将1.66g苯二甲酸和0.93g的苯胺溶于100mL水饱和的正丁醇中。

（3）芦丁、槲皮素的纸色谱和聚酰胺薄层色谱鉴定 样品：自制芦丁、槲皮素的乙醇液 色谱材料：新华滤纸，聚酰胺薄膜 对照品：芦丁、槲皮素的乙醇溶液

展开剂： 正丁醇-乙酸-水（4:1:5）上层溶液（纸色谱）。90%乙醇或乙醇-水（7:3）（聚酰胺色谱）。

显色：

①可见光下观察及紫外灯下观察。 ②喷三氯化铝试剂后再观察。

【基本操作注意事项】

1.加入石灰乳即可达到碱溶解提取芸香苷目的，又能使槐米中含存的大量粘液质生成钙盐沉淀除去，但应严格控制在pH8～9，不得超过10。pH过高，在加热提取过程中可促使芸香苷水解破坏，造成产率明显下降。酸沉时加浓硫酸调pH3～4，不宜过低，否则会使芸香苷生成盐溶于水，也会降低收率。

2.加入硼砂的目的是使其与芸香苷邻二酚羟基结合，这样既保护邻二酚羟基不被氧化破坏，亦保护邻二酚羟基不与钙离子络合，使芸香苷不受损失。同时还有调节碱性水溶液PH值的作用。

3.芸香苷的提取还可以利用芸香苷在冷、热水中的溶解度不同，采用沸水提取法。

【思考题】

1.苷类水解有几种催化方法？

2.试解释芸香苷水解过程中出现的混浊→澄清→混浊现象。 3.怎样正确鉴定芸香苷？

4.本实验提取过程中应注意哪些问题？

实验三 穿心莲中穿心莲内酯的提取、分离与鉴别

【实验目的】

1.掌握从穿心莲药材中提取亲脂性成分的原理和方法。 2.掌握除去叶绿素的原理和方法。

3.熟悉内酯类成分的主要理化性质及鉴别方法。 【实验原理】

1.穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees的全草。穿心莲中含有多种二萜类化合物，主要为穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯等。

（1）穿心莲内酯(andrographolide)。分子式C20H30O5，分子量350.44。无色方形或长方形结晶，味极苦。mp.230～231℃，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶中，微溶于氯仿、乙醚、难溶于水、石油醚、苯。

（2）新穿心莲内酯(neoandrographolide)。分子式C26H40O8，分子量480.58。无色柱状结晶，无苦味。mp.167～168℃，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶中，微溶于水，较难溶于苯、乙醚、氯仿及石油醚。

（3）去氧穿心莲内酯(deoxyandrographolide)。分子式C20H30O4，分子量334.44。无色片状（丙酮、乙醇或氯仿）或无色针状结晶（醋酸乙酯），味稍苦。mp.174～175℃。易溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶、氯仿，可溶于乙醚、苯中，微溶于水。 D

（4）脱水穿心莲内酯(dehydroandrographolide) 分子式C20H28O4,分子量332.42。无色针状结晶（30%或50%乙醇），mp.204℃。易溶于乙醇、丙酮，可溶于氯仿，微溶于苯，几不溶于水。

1522.5

O1316OOOOHO201011OOOCH2HO1817CH2HOCH2OHCH2HOHCH2OHCH2OH19glcOCH2

穿心莲内酯 去氧穿心莲内酯 新穿心莲内酯 脱水穿心莲内酯

2.本实验是利用穿心莲内酯类成分易溶于甲醇、乙醇、丙酮等溶剂的性质，选用乙醇为提取溶剂进行提取。穿心莲中含有大量叶绿素，故用活性炭吸附，除去叶绿素等脂溶性杂质。又根据穿心莲内酯与去氧穿心莲内酯在氯仿中溶解度不同而进行分离。也可利用穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯及新穿心莲内酯结构上的差异所表现的极性不同，用氧化铝柱

色谱分离。

【实验仪器与试剂】

1.减压浓缩器，1000、500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，水浴锅，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，纱布，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机，超声波振荡器，层析柱（Ф1.5cm）

2.穿心莲粗粉，滤纸，pH试纸，活性炭，氯仿，中性氧化铝（柱层析用），7%盐酸羟胺甲醇溶液，氢氧化钾甲醇溶液，稀盐酸，1%三氯化铁溶液，0.3%亚硝酰铁氰化钠溶液，10%氢氧化钠溶液，碱性3,5-二硝基苯甲酸试剂，薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，甲醇，穿心莲内酯对照品，展开剂：①氯仿-甲醇（9∶1），②氯仿-正丁醇-甲醇（2∶1∶2）

【实验步骤】1.提取

方法Ⅰ： 穿心莲叶粗粉200g

加10倍量80%乙醇浸渍提取2次， 每次2天，滤过

滤液 药渣

浓缩至小体积

总浓缩液

加原料量15%～20%活性炭，加热回流30min 趁热滤过

滤液 活性炭渣

浓缩至原料量10%（V/W），静置析晶，滤过

内酯类结晶粗品

方法Ⅱ： 穿心莲叶粗粉200g

10倍量乙醇分3次超声波振荡提取， 每次30min，滤过

滤液 药渣 回收乙醇至500ml左右

总浓缩液

加原料量15%～20%活性炭，加热回流30min 趁热滤过 滤液 活性炭渣

浓缩至原料量10%（V/W），静置析晶，滤过

内酯类结晶粗品

2.精制

内酯类结晶粗品

不溶物 氯仿液

加15倍量95%乙醇溶解，加1%活 性炭回流30mi， 滤过

滤液 活性炭渣

回收乙醇至半，放冷析晶，滤过

氯仿冷浸溶解，滤过 内酯类结晶精制品

3.分离

内酯类结晶精制品

加少量氯仿溶解

氯仿溶液

中性氧化铝柱 氯仿洗脱 氯仿-无水乙醇（9.6∶0.4）洗脱 去氧穿心莲内酯 粗晶

95%乙醇重结晶

50%乙醇洗脱 新穿心莲内酯

穿心莲内酯

4.穿心莲内酯类成分的检识

（1）异羟肟酸铁反应 取穿心莲内酯结晶数毫克，加乙醇1ml溶解，加7%盐酸羟胺甲醇溶液2～3滴，加10%氢氧化钾甲醇溶液1～2滴使呈碱性，于水浴上加热2分钟，放冷后，加稀盐酸使呈酸性，加1%三氯化铁溶液1～2滴，混匀，呈紫红色。

（2）Legal反应 取穿心莲内酯结晶少许，加乙醇1ml溶解，加0.3%亚硝酰铁氰化钠溶液2～4滴，加10%氢氧化钠溶液1～2滴，呈紫色。

（3）Kedde反应 取穿心莲内酯结晶少许，加乙醇1ml溶解，加碱性3,5-二硝基苯甲酸试剂2滴，呈紫色。

（4）穿心莲内酯类成分的薄层色谱检识 薄层板：硅胶H-CMC-Na

试 样：自制穿心莲内酯乙醇溶液 对照品：穿心莲内酯对照品乙醇溶液 展开剂：①氯仿-甲醇（9∶1）

②氯仿-正丁醇-甲醇（2∶1∶2）

显色剂：喷雾Kedde试剂，加热显色

【基本操作注意事项】

1.穿心莲内酯类化合物为二萜类内酯，性质极不稳定，易氧化、聚合而树脂化。因此提取所用的穿心莲应是当年产的新药材，并且要未受潮变质的茎叶部分，否则内酯含量明显下降至极低，难以提取得到。

2.提取时，如用热乙醇加热回流提取穿心莲总内酯，能同时提出大量穿心莲中的叶绿素、树脂以及无机盐等杂质。使析晶和精制较为困难，因此本实验用冷浸法和超声波振荡法提取。

3.以超声波振荡法提取省时，浓缩析晶时脂溶性杂质少，易得到黄色结晶，得率高。 4.穿心莲内酯的析晶宜在含乙醇量稍高的情况下进行，此时晶形与结晶的纯度都较好。当溶液的含水量较高，或粘稠度太大时，往往不易析出结晶。

【思考题】

1.叶绿素除用活性炭吸附法去除外，还可采用哪些方法去除？ 2.穿心莲总内酯的分离可采用哪些方法？试比较各种方法的优缺点。

3.根据穿心莲内酯类成分的结构，试判断其极性的强弱，在进行吸附薄层色谱时其Rf值大小如何？

4.Legal反应和Kedde反应的机理是什么？什么样的结构才有阳性反应？

实验四 八角茴香挥发油的提取及鉴别

【实验目的】

1.掌握挥发油的水蒸气蒸馏提取法。

2.掌握挥发油中化学成分的薄层点滴定性检识。 3.熟悉挥发油的一般检识。

4.了解挥发油单向二次薄层色谱检识。 【实验原理】

1.为木兰科植物八角茴香Illicium verum Hook..f.的干燥成熟果实。分布于广西、贵州、云南等省区。含挥发油4％～9％，脂肪油约22％（主要存在于种子中）及蛋白质、树胶、树脂等。挥发油中主要成分是茴香醚，约为总挥发油的80％～90％，冷时常自油中析出，故称茴香脑。此外，尚含莽草酸及少量甲基胡椒酚、茴香醛、茴香酸等。

OCH3COOHOCH3CHOCOOHHOCHCHCH3OHOH

CH2CHCH2

OCH3

OCH3

茴香醚（脑） 甲基胡椒酚 茴香醛 莽草酸 茴香酸

（1）茴香脑(anethole) 又称大茴香醚、茴香烯、茴香醚。分子式C10H12O，分子量148.21。为白色结晶，mp.21.4℃，bp.235℃。与乙醚、氯仿混溶，溶于苯、醋酸乙酯、丙酮、二硫化碳及石油醚，几不溶于水。

（2）莽草酸(shikimic acid) 又称毒八角酸。分子式C7H10O5,分子量174.15。无色针状结晶（甲醇—醋酸乙酯），mp.190～191℃。在100ml水中可溶解18g，100ml无水乙醇中可溶解2.5g，几乎不溶于氯仿、苯、石油醚。

（3）甲基胡椒酚(methylchavicol) 分子式C10H12O，为无色液体，bp.215～216℃。 （4）茴香醛 (anisaldehyde) 分子式C8H8O2，有两种状态：棱晶，mp.36.3℃，bp.236℃；液体，mp.0℃，bp.248℃。

（5）茴香酸 (anisic acid) 分子式C8H8O3，针状结晶，mp.184℃，bp.275～280℃。 2.本实验是水蒸气蒸馏法提取挥发油的通法。挥发油的组成成分较复杂，常含有烷烃、烯烃、醇、酚、醛、酮、酸、醚等官能团。因此可以用一些检出试剂在薄层板上进行点滴试验，从而了解组成挥发油的成分类型。挥发油中各类成分的极性互不相同，一般不含氧的烃类和萜类化合物极性较小，在薄层色谱板上可被石油醚较好的展开；而含氧的烃类和萜类化合物极性较大，不易被石油醚展开，但可被石油醚与醋酸乙酯的混合溶剂较好的展

开。为了使挥发油中各成分能在一块薄层色谱板上进行分离，常采用单向二次色谱法展开。

【实验仪器与试剂】

1.100、10ml烧杯，250ml三角烧瓶，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，洗瓶，蒸馏装置，电热套，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，显色剂喷瓶，小型空压机。

2.八角茴香粗粉，滤纸，三氯化铁试剂，2,4-二硝基苯肼试剂，碱性高锰酸钾试剂，香草醛-浓硫酸试剂（临时配用），0.05%溴酚蓝试剂，硝酸铈铵试剂，柠檬油，丁香油，薄荷油，樟脑油，桉叶油，松节油，丙酮，石油醚（30～60℃），醋酸乙酯。

【实验步骤】 1.茴香脑的提取分离

取八角茴香粗粉50g，置圆底烧瓶中，加适量水浸泡湿润，按一般水蒸气蒸馏法进行蒸馏提取。也可将捣碎的八角茴香置于挥发油测定器的烧瓶中，加蒸馏水500ml与数粒玻璃珠，连接挥发油测定器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并使溢流入烧瓶时为止。缓缓加热至沸，至测定器中油量不再增加，停止加热，放冷，分取油层。将所得的八角茴香油置冰箱中冷却1小时，即有白色结晶析出，趁冷滤过，用滤纸压干。结晶为茴香脑，滤液为析出茴香脑后的八角茴香油。

2.检识

（1）油斑试验 取八角茴香油适量，滴于滤纸片上，常温下（或加热烘烤），观察油斑是否消失。

（2）薄层色谱板点滴反应 取硅胶G薄层色谱板1块，用铅笔按表画线。将挥发油试样用5～10倍量乙醇稀释后，用毛细管分别滴加于每排小方格中，再将各种检识试剂用滴管分别滴于各挥发油试样斑点上，观察颜色变化。初步推测每种挥发油中可能含有化学成分的类型。

实-表1 挥发油薄层板点滴反应 试剂 试样 八角茴香油 柠檬油 丁香油 薄荷油 樟脑油 桉叶油 松节油 空白对照

1 2 3 4 5 6 试剂 1．三氯化铁试剂 2．2,4-二硝基苯肼试剂 3．碱性高锰酸钾试剂 4．香草醛-浓硫酸试剂 5．0.05％溴酚蓝试剂 6．硝酸铈铵试剂

（3）挥发油薄层色谱单向二次展开检识 取硅胶H-CMC-Na薄层板（6cm×15cm）一块，在距底边1.5cm及8cm处分别用铅笔画起始线和中线。将八角茴香油溶于丙酮，用毛细管点于起始线上呈一长条形，先用石油醚（30～60℃）-醋酸乙酯（85∶15）为展开剂展开至薄层板中线处取出，挥去展开剂，再放入石油醚（30～60℃）中展开至接近薄层板顶端时取出，挥去展开剂后，分别用下列几种显色剂喷雾显色。

①1％香草醛-硫酸试剂：可与挥发油产生紫色、红色等。 ②荧光素-溴试剂：如产生黄色斑点，表明含有不饱和化合物。 ③2,4-二硝基苯肼试剂：如产生黄色斑点，表明含有醛或酮类化合物。 ④0.05％溴甲酚绿乙醇试剂：如产生黄色斑点，表明含有酸性化合物。

观察斑点的数量、位置及颜色，推测每种挥发油中可能含有化学成分的种类及数量。

【基本操作注意事项】

1.通过观察馏出液的混浊程度来判断挥发油是否提取完全。最初的馏出液中含油量较多，明显混浊，随着馏出液中油量的减少，混浊度也随着降低，至馏出液变为澄清甚至无挥发油气味时，停止蒸馏。

2.提取完毕，须放冷，待油水完全分层后，再将油层放出，尽量不带出水分。 3.进行单向二次展开时，先用极性较大的展开剂展开至中线，然后再用极性较小的展开剂展开。在第一次展开后，应将展开剂完全挥干，再进行第二次展开，否则将影响第二次展开剂的极性，从而影响分离效果。

4.挥发油易挥发逸失，因此进行色谱检识时，操作应迅速及时，不宜久放。 5.喷洒香草醛-浓硫酸显色剂时，应于通风橱内进行；用溴甲酚绿试剂显色时，应避免在酸性条件下进行。

【思考题】

1.从八角茴香中提取分离茴香脑的原理是什么？ 2.利用点滴反应检识挥发油的组成优点是什么？

3.单向二次展开薄层色谱法检识挥发油中各成分时，为什么第一次展开所用的展开剂极性最好大于第二次展开所用的展开剂的极性？单向二次展开薄层色谱法有什么优点？

实验五 大黄中蒽醌苷元的提取、分离与鉴别

【实验目的】

1.掌握从大黄中提取和分离游离蒽醌的方法。

2.掌握用pH梯度萃取法分离不同酸性的羟基蒽醌类化合物。 3.掌握蒽醌类化合物的主要检识方法。 4.熟悉蒽醌类化合物的色谱检识方法。 5.了解用柱色谱法分离蒽醌类成分。 【实验原理】

1.大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄R.tanguticum Maxim. ex Reg.和药用大黄R. officinale Baill.的干燥根及根茎。大黄中含有大黄蒽醌及其苷。

（1）大黄酸(rhein) 分子式C15H8O6，分子量284.21。黄色针状结晶（升华法），mp.321～322℃，330℃分解。能溶于碱水、吡啶，溶于乙醇、氯仿、乙醚和石油醚，几不溶于水。

（2）大黄素(emodin) 分子式C15H10O5，分子量270.23。橙色针状结晶(乙醇)，mp.256～257℃，能升华。易溶于乙醇、碱水，微溶于乙醚、氯仿，几不溶于水。

（3）芦荟大黄素(aloe-emodin) 分子式C16H10O5，分子量270.23。橙色针状结晶（甲苯），mp.223～224℃。易溶于热乙醇，可溶于乙醚和苯，并呈黄色；溶于碱液呈红色；氨水及硫酸中呈绯红色。

（4）大黄酚(chrysophanol) 分子式C15H10O4，分子量254.23。橙黄色六方形或单斜结晶（乙醇或苯），mp.196～197℃，能升华。易溶于沸乙醇，可溶于丙酮、氯仿、苯、乙醚和冰醋酸，极微溶于石油醚、冷乙醇，几不溶于水。

（5）大黄素甲醚(physcion) 分子式C16H12O5，分子量284.26。砖红色单斜针状结晶，mp.203～207℃，溶于苯、氯仿、吡啶及甲苯，微溶于醋酸及醋酸乙酯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮。

OHOOHR2OR1大黄酚 R1=CH3 R2=H

大黄素 R1=CH3 R2=OH 大黄酸 R1=COOH R2=H

大黄素甲醚 R1=CH3 R2=OCH3 芦荟大黄素 R1=CH2OH R2=H

2.本实验是根据大黄中的羟基蒽醌苷经酸水解成游离羟基蒽醌，而游离羟基蒽醌不溶于水，可溶于氯仿、乙醚等亲脂性有机溶剂的性质，用氯仿从水解液中将游离羟基蒽醌提取出来，再利用各游离羟基蒽醌的酸性不同，采用pH梯度萃取法将其分离。其中大黄酚和大黄素甲醚的酸性十分近似，用pH梯度萃取法难以分离，可利用两者的极性不同，采

用硅胶柱色谱法进行分离。

【实验仪器与试剂】

1.索氏提取器，500、100、10ml烧杯，1000、500ml分液漏斗，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，水浴锅，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机，层析柱（Ф1.5cm）

2.大黄粗粉，滤纸，pH试纸，乙酸乙酯，石油醚（60～90℃），氯仿，20％硫酸，pH8缓冲液，pH9.9缓冲液，浓盐酸，5％碳酸钠，5％氢氧，丙酮，10％氢氧化钠，0.5%醋酸镁乙醇试剂，薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，甲醇，大黄酸、大黄素、芦荟大黄素对照品，展开剂：石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）上层溶液，浓氨水。

【实验步骤】 1. 提取与分离

大黄粗粉100g

加20％硫酸200ml，加热回流3小时，放冷， 加乙酸乙酯300ml＋石油醚100ml，振摇，滤过

乙酸乙酯、石油醚提取液 药渣

水洗余酸至中性

乙酸乙酯、石油醚提取液

加pH8缓冲液150ml萃取 碱水液 乙酸乙酯、石油醚提取液

盐酸调pH3，静置，滤过 加pH9.9缓冲液300ml萃取 沉淀

冰醋酸精制 乙酸乙酯、石油醚提取液 碱水层

大黄酸

5％碳酸钠-5％氢氧 盐酸调pH3，滤过

化钠（9∶1）540ml 沉淀 萃取 丙酮精制

大黄素

乙酸乙酯、石油醚提取液 碱水层

3％氢氧化钠500ml萃取 盐酸调pH3，滤过

沉淀

碱水层 乙酸乙酯、石油醚提取液 醋酸乙酯精制

盐酸调pH3，滤过 芦荟大黄素

沉淀

硅胶柱色谱

大黄酚 大黄素甲醚

2．检识

（1）碱液试验 分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴10％氢氧化钠试剂振摇，观察颜色变化，羟基蒽醌应显红色。

（2）乙酸镁试验 分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴0.5％乙酸镁乙醇试剂，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙、红、紫等颜色。

（3）薄层色谱检识 薄层板：硅胶H-CMC-Na

试 样：自制大黄酸、大黄素、芦荟大黄素的乙醇溶液。 对照品：上述各成分对照品乙醇溶液（约1mg/ml）。

展开剂：石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）上层溶液。

显 色：在可见光下观察，记录黄色斑点的位置。然后再用浓氨水熏蒸或喷雾5％乙酸镁甲醇溶液，斑点应显红色。

【基本操作注意事项】

1.大黄中蒽醌类化合物的种类、含量与大黄的品种、采集季节、炮制方法及贮存时间均有关系，实验用药材应注意。

2.萃取用pH8缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 ；pH9.9缓冲液为碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。配制好的缓冲液要测pH值。一般萃取大黄酸用pH7～8范围的，萃取大黄素用pH9.5～11范围的。

3.用各缓冲液进行萃取时，采用一次性加入的方法，实验证明，如将缓冲液分次萃取，分离效果不理想。

4.本实验也适应于以虎杖为原料的提取，但虎杖中不含大黄酸，故直接由大黄素开始分离。

5.色谱分离大黄酚及大黄素甲醚时，先用氯仿洗脱至出现黄色色带时，改用氯仿—醋酸乙酯（8∶2）混合溶剂继续洗脱，并更换收集器，每10ml为一份，按顺序编号，直至色谱柱的第一色带全部洗脱下来为止。各流分经硅胶-CMC-Na板，氯仿－醋酸乙酯(8∶2)展开，用大黄酚和大黄素甲醚作对照，合并斑点相同流分，分别浓缩、放置析晶，即可获得大黄酚及大黄素甲醚。

【思考题】

一、大黄游离蒽醌的提取分离方法还有哪，同时注意实验成本、仪器、安全、环保等多因素思考。

二、（1）大黄中5种羟基蒽醌化合物的酸性和极性大小应如何排列？为什么？ （2）pH梯度萃取法的原理是什么？适用于哪些中药成分的分离？ （3）蒽醌类化合物及其苷的薄层色谱用什么作吸附剂、展开剂和显色剂？ （4）蒽醌类与乙酸镁显色反应的必要条件是什么？其颜色反应与羟基所在的位置有何关系？

实验五 苦参生物碱的提取、分离与鉴别

【实验目的】

1.掌握用离子交换树脂提取、分离生物碱的原理和方法。 2.掌握苦参生物碱的提取、分离与鉴别 3.学习离子交换树脂的处理与再生方法。

【实验原理】

1.苦参中生物碱主要是苦参碱和氧化苦参碱。除此之外还含有羟基苦参碱(hydroxymatrine)、N-甲基金雀花碱(N-methylcytisine)等多种生物碱。分子结构中均有两个氮原子，一个为叔胺，一个为酰胺。

OONNHOONNNNCH3N

O

N

O

苦参碱 氧化苦参碱 羟基苦参碱 N-甲基金雀花碱 苦参中的生物碱具有多方面的生理活性。现代临床及药理学研究表明，总生物碱具有消肿利尿、抗肿瘤、抗病原体作用，同时具有抗心率失常、正性肌力、抗缺氧、扩张血管、降血脂、抗柯萨奇病毒、调节免疫等作用。临床上除治疗常规疾病外，还用于治疗心率失常、心力衰竭、病毒性心肌炎、冠心病等。

（1）性状 苦参碱有α-、β-、γ-、δ-四种形态。其中α-、β-、δ-苦参碱为结晶体，γ-苦参碱为液体。常见的是α-苦参碱，为针状或棱柱状结晶，mp.76 ℃。氧化苦参碱为无色正方体状结晶（丙酮），mp.207 ～208℃（分解）。含一分子结晶水的氧化苦参碱mp.77 ～78 ℃。

（2）溶解性 苦参碱既可溶于水，又能溶于氯仿、乙醚、苯、二硫化碳等亲脂性溶剂。氧化苦参碱是苦参碱的N-氧化物，具有半极性配位键，其亲水性比苦参碱更强，易溶于水，可溶于氯仿，但难溶于乙醚。可利用二者在乙醚中的溶解性差异进行分离。苦参中生物碱的极性大小顺序是：氧化苦参碱＞羟基苦参碱＞苦参碱。

（3）水解性及氧化还原反应 苦参碱、氧化苦参碱和羟基苦参碱具有内酰胺结构，可水解生成羧酸衍生物，酸化后又脱水环合为内酰胺结构。如苦参碱在5% KOH中加热，水解成苦参酸钾，酸化后又环合为苦参碱。N-甲基金雀花碱是芳香性的内酰胺碱，稳定性

大，在同样水解条件下不易水解生成钾盐，可利用这一性质与苦参碱分离。

在植物体内，70%以上苦参碱以氧化苦参碱状态存在。

2.苦参中生物碱主要有苦参碱和氧化苦参碱。分子结构中均有两个氮原子，一个为叔胺，一个为酰胺。苦参生物碱可与酸结合成盐，因此用酸水提取后，生物碱呈阳离子状态而被阳离子交换树脂所交换，再用氨水碱化后使生物碱游离，用有机溶剂回流提取之。

苦参碱既可溶于水，又能溶于氯仿、乙醚、苯、二硫化碳等亲脂性溶剂。氧化苦参碱是苦参碱的N-氧化物，易溶于水，可溶于氯仿，难溶于乙醚。也可利用二者在乙醚中的溶解性差异进行分离。氧化苦参碱的极性大于苦参碱。

【实验仪器与试剂】

1.索氏提取器，参漉筒，阳离子交换树脂，500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，水浴锅，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机，层析柱（Ф1.5cm）

2.苦参粗粉，滤纸，pH试纸，2mol/L盐酸，浓盐酸，丙酮，改良碘化铋钾试剂（临时配用），薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，0.2%氢氧化钠，甲醇，苦参碱、氧化苦参碱对照品，苦参碱展开剂：甲苯－乙酸乙酯－甲醇－水（2:4:2:1）10℃下放置的上层溶液，氧化苦参碱展开剂：氯仿-甲醇－浓氨试液（5:0.6:0.3）10℃下放置的下层溶液，2mol/LNaCl，无水硫酸钠。

【实验步骤】

1.树脂的处理 由于市售的阳离子交换树脂为钠型，同时含水量不足未充分膨胀，而且往往含有杂质。因此使用前须进行转型、除杂和吸水膨胀处理，其方法如下：

取市售阳离子交换树脂（如聚苯乙烯磺酸型树脂，交联度1×7）120g，置烧杯中，加蒸馏水洗至水色较浅，再加蒸馏水浸泡树脂并在80℃水浴上加热1h（或室温下浸泡1天），以便树脂充分膨胀。减压抽干后加入2mol/LHCl200mL，不断搅拌，浸泡1h，倾去酸水，再加2mol/LHCl 400mL浸泡过夜。将树脂装入色谱柱中，再将浸泡用的2mol/LHCl全部通过树脂（4～5mL/min），然后用蒸馏水洗至pH4～5，备用。

2.苦参生物碱的提取和交换 取苦参粗粉100g，加适量0.1%HCl湿润膨胀后，装入渗漉筒中，以0.1%HCl1500mL渗漉，流速2～3mL/min。渗漉筒与交换柱相联，渗漉液通过装

有湿重60g树脂的阳离子交换柱交换，交换速度为2～3mL/min，测定不同交换时间的pH变化。然后将吸附树脂倒入烧杯中，以蒸馏水洗至洗液无色，抽干后置搪瓷盘中室温晾干。

3.总生物碱的洗脱 将上述晾干的树脂置烧杯中，加入适量10%氨水，搅匀，以手摸有潮湿感但不粘手为宜。放置20min，装入滤纸袋中置索氏提取器中，以氯仿连续回流提取至提取液无生物碱反应（取提取液中部的氯仿液滴在滤纸上喷改良碘化铋钾试剂）。氯仿液加无水硫酸钠脱水后，回收氯仿至干。残留物用丙酮20mL回流溶解，必要时抽滤，然后回收2/3的丙酮，放置，结晶，抽滤，干燥，即得粗品总碱的白色结晶。

4.薄层鉴定

吸附剂：0.2%氢氧化钠制硅胶H-CMC-Na板二块。 样品液：总碱乙醇液（每1mL含0.5mg），点样5μL。

标准品：苦参碱对照品乙醇液（每1mL含0.5mg），氧化苦参碱对照品乙醇液（每1mL含0.5mg），分别点样5μL。

苦参碱展开剂：甲苯－乙酸乙酯－甲醇－水（2:4:2:1）10℃下放置的上层溶液。 氧化苦参碱展开剂：氯仿-甲醇－浓氨试液（5:0.6:0.3）10℃下放置的下层溶液。 显色剂：依次喷碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液，显橙色斑点。 结果：记录对照样品斑点和对照品斑点的颜色和位置，计算Rf值。

5.树脂再生 使用过的树脂用蒸馏水洗去杂质并抽干。然后以2mol/LHCl浸泡后装柱，使酸液通过树脂进行交换，再用水洗去酸液。接着再用1～2mol/LNaOH（或NaCl）进行交换，再用水洗去碱液，复用2mol/LHCl浸泡后通过树脂，用水洗去酸液后即可再用。树脂不用时应加水，保存在广口瓶中。

【基本操作注意事项】

1.苦参粗粉过10目筛即可，不宜太粗或太细。

2.树脂使用前应用水充分膨胀，否则交换效率低，重现性差。 3.喷改良碘化铋钾试液前薄层板上残留展开剂要挥干。

【思考题】

一、苦参生物碱的提取分离方法还有哪，同时注意实验成本、仪器、安全、环保等多因素思考。

二、（1）离子交换树脂分离苦参生物碱的基本原理是什么？

（2）为什用氢氧化钠制硅胶板？为什么苦参碱、氧化苦参碱用不同的展开剂？二者的展开剂交换使用结果会怎样？

（3）树脂再生应注意什么问题？

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