实验十二 双缩脲法测蛋白质含量

实验十二 双缩脲法测蛋白质含量

【目的和要求】

掌握双缩脲法定量测写蛋白质含量的原理和方法。

【原理】

蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与C u2

＋

形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于

量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。

540～560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。标准蛋白质溶液可以用结晶的牛（或人）血清清蛋白、卵清蛋白或粉末配制。

除—CONH—有此反应外，—CONH2，—CH2—NH2，—CS—NH2等基团亦有此反应。 血清总蛋白含量关系到血液与组织间水分的分布情况，在机体脱水的情况下，血清总蛋白质含量升高，而在机体发生水肿时，血清蛋白含量下降，所以测定血清蛋白质含量具有临床意义。

【操作方法】

一、绘制标准曲线(学生自己列表，依次加入溶液)

取一系列试管，分别加入0， 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0ml的标准酪蛋白溶液（作为标准用的应当用凯氏定氮法测定蛋白氮含量,以确定酪蛋白的纯度），用水补足到2ml，然后加入4ml双缩脲试剂在室温下（15℃～25℃）放置30min，于540nm波长下用72型分光光度计比色测定。最后以光密度为纵坐标，酪蛋白的含量为横坐标绘制标准曲线，作为定量的依据。

二、未知样品蛋白质浓度的测定

未知样品必须进行稀释调整，使2ml中含有1～10mg蛋白质，才能进行测定。 吸取1ml 1:10稀释的血清待测液，用水补足到2ml。操作同前，平行做两份。

与标准曲线的各管同时比色。比色后从标准曲线上查出其蛋白质浓度，再按照稀释倍数求出每毫升血清原液的蛋白质含量。

【试剂和器材】

一、试剂

（1）标准酪蛋白溶液（5mg/ml）：用0.05N氢氧化钠配制。

（2）双缩脲试剂：溶解1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）于500ml水中，在搅拌下加入300ml 10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1升，贮存在内壁涂以石腊的瓶中。此试剂可长期保存，以备使用。 （3）血清稀释液：人血清原液用水稀释10倍，冰箱保存待用。

二、器材

（1）吸量管（1ml,2ml,5ml） （2）试管及试管架 （3）72型分光光度计

【思考题】

1．如何选择未知样品的用量？

2．为什么作为标准的蛋白质必须用凯氏定氮法测定纯度？ 3．对于作为标准的蛋白质应有何要求？

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