柴芩清肝汤高效液相色谱指纹图谱研究

【摘要】  目的对柴芩清肝汤的HPLC指纹图谱进行研究，建立其质量评价体系。方法采用HPLC梯度洗脱技术进行分离。色谱柱为Diamonsil C18(5 μm, 250 mm×4.6 mm)，保护柱为Diamonsil C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，检测波长230 nm，柱温25℃。结果确定了19个共有峰，并对各共有峰进行了初步归属。10批样品指纹图谱的相似度均在0.90以上。结论该方法准确可控，可用于柴芩清肝汤的质量控制。

【关键词】  柴芩清肝汤;高效液相色谱;指纹图谱

　柴芩清肝汤的原方是由柴胡、黄芩、白芍、甘草等制成的中药制剂，经多年的临床实践证明，其对慢性肝炎等疾病有较好的疗效。该方剂是集中医理论、现代研究和临床经验为一体的良好组合，具有疏肝解郁、消热解毒之功效。由于中药复方成分复杂，仅对某个成分进行定性、定量分析并不能有效控制其质量，中药指纹图谱作为目前公认的中药和天然药物质量控制的有效手段，其研究着眼于对象的宏观特征及内在规律，具有整体性和模糊性等基本特点，符合中药药效模式[1，2]。本实验运用HPLC法对柴芩清肝汤进行研究，确立其色谱条件，建立指纹图谱共有模式，从而从整体上控制柴芩清肝汤的质量。

　　1仪器与试药

　　Waters600-2487型高效液相色谱仪 Empower色谱工作站(美国.沃特斯公司);AG 135型电子天平(瑞士METTLER-TOLEDO公司);KQ-300VDE型双频数控超声泼清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。柴胡、黄芩等药材均购于哈尔滨市宝丰大药堂，经检验符合《中国药典》规定。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为分析纯。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件色谱柱为Diamonsil C18(5 μm, 250 mm×4.6 mm)，保护柱为Diamonsil C18;流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，见表1;流速1.0 ml/min; 柱温25℃;检测波长230 nm;进样量10 μl。

　　2.2对照品溶液的制备取黄芩苷、芍药苷和甘草苷各5 mg，精密称定，分别置5 ml容量瓶中，加甲醇适量使溶解，定容，即得。

　　2.3供试品溶液的制备取柴胡、黄芩、白芍、甘草药材，制成柴芩清肝汤[3]。经冷冻干燥制成冻干粉。同法制备10批冻干粉。精密称取冻干粉0.5 g， 置25 ml容量瓶中，加甲醇20 ml，超声处理30 min，放凉，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。同法制得10批冻干粉的供试品溶液。表1梯度洗脱程序

　　2.4参照峰的选择黄芩苷为本方有效成分之一，在HPLC图谱中峰面积较大，出峰时间适中且稳定，故选择黄芩苷为参照峰[4]。

　　2.5方法学考察

　　2.5.1精密度实验精密吸取同一供试品溶液10 μl，连续进样5次，记录指纹图谱。以13号峰黄芩苷为参照峰，各共有色谱峰保留时间的RSD值均在0.5%以下, 各共有色谱峰相对峰面积间的RSD值均在5.0%以下。表明进样方法和仪器精密度良好。

　　2.5.2稳定性实验精密吸取同一供试品溶液10 μl，分别在0，2，4，6，8，12，24 h进样，记录指纹图谱。以13号峰黄芩苷为参照峰，各共有色谱峰保留时间的RSD值均在0.6%以下, 各共有色谱峰相对峰面积间的RSD值均在5.0%以下。表明样品溶液在24 h内稳定。

　　2.5.3重复性实验取同一批样品5份，按供试品制备方法进行制备，记录指纹图谱。结果，各共有色谱峰保留时间的RSD值均在0.6%以下, 各共有色谱峰相对峰面积间的RSD值均在5.0%以下。样品处理方法重复性良好。

　　2.6指纹图谱的建立将各供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定各样品的HPLC指纹图谱，见图1。经比较分析，确定19个色谱峰为柴芩清肝汤的共有峰，见图2。通过与药材指纹图谱的比较，对各峰进行了归属，其中1~5号峰来自白芍;6,7,10,13~20号峰来自黄芩;9号峰来自甘草。8号峰为白芍，黄芩，甘草共有;11号峰为白芍，甘草共有;12号峰为甘草，黄芩共有。通过与对照品比较，确定5号峰为芍药苷，9号峰为甘草苷，13号峰为黄芩苷。图1柴芩清肝汤10批样品的HPLC指纹图谱

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