桂枝对MRL小鼠心肌细胞凋亡及Caspase 3基因表达的影响

【摘要】  目的探讨中药桂枝对MRL小鼠心肌细胞凋亡的作用及对Caspase 3基因表达的影响。方法将MRL小鼠分为空白组、强的松组和桂枝组，检测MRL小鼠心肌组织凋亡细胞，计算心肌细胞凋亡指数（AI），ＲＴ-ＰＣＲ法检测心肌细胞凋亡基因Caspase 3表达，观察桂枝对MRL小鼠心肌细胞凋亡的影响。结果桂枝能调控心肌细胞凋亡基因Caspase 3表达，即抑制Caspase 3表达，明显抑制心肌细胞凋亡(心肌细胞凋亡指数显著下降)。其疗效明显优于空白组（P<0.05），有显著性差异，与强的松组疗效相当（P>0.05）。结论桂枝可能通过调控凋亡基因而抑制心肌细胞凋亡，从而延缓或部分逆转MRL心肌损害的发生、发展。

【关键词】  MRL小鼠； 细胞凋亡； Caspase 3基因表达

系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一种多因素参与的累及全身多脏器、多系统的自身免疫性疾病，现代医学多采用肾上腺糖皮质激素、免疫抑制剂、非甾体抗炎药等治疗，但有明显的副作用，停药后病情也易反复，治疗现状不容乐观。目前在中医中药领域内寻找治疗SLE及SLE心肌损害的有效药物，并从调控凋亡基因、抑制细胞凋亡切入研究其作用机理，是一项很有裨益的探索。本实验对MRL小鼠应用桂枝进行了该方面的探讨。

　　1  材料与仪器

　　1.1  动物

　　8～10周龄雌性MRL小鼠，体质量20～25 g，由上海动物中心提供。

　　1.2  药品桂枝药物由河北工程大学附属教学中医院提供，强的松片由浙江仙居制药厂生产。

　　1.3  试剂RNA提取试剂Trizol Reagent购自华美生物工程公司，为Invitrogen公司产品；逆转录酶（AMV-RT ），核糖核酸酶抑制剂（RNasin），dNTP，Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase），随机引物（Random primers），琼脂糖（agarose）均购自美国Promega 公司。

　　1.4 仪器756型紫外分光光度计为上海精密仪器厂生产；GeneAmp 9600型PCR仪 为美国PE公司生产；RS-28高速低温离心机为 德国贺利氏公司生产；超低温冰箱为德国贺利氏公司生产；UVP凝胶扫描系统由美国UVP 公司生产；微量移液器 为德国Gilson公司生产；DYZ-22A型双恒定时电泳仪为北京市六一仪器厂生产；DYY-Ⅲ桥式电泳仪为北京市六一仪器厂生产。

　　2  方法

　　2.1  实验分组与给药36只雌性MRL小鼠，随机分为3组，即空白对照组，强的松组，桂枝组，各12只。空白对照组给予生理盐水灌胃1ml/d，强的松组给予强的松混悬液灌胃0.02 g·ml-1·d-1，桂枝组给予桂枝煎剂0.12 g·ml-1·d-1，分两次给予，各组灌胃3周后处死动物，取心室肌组织。

　　2.2  检测指标与方法

　　2.2.1  心肌细胞凋亡Ladder电泳用碱裂解法提取心肌ＭＤＡ,洗涤,ＴＥ过夜溶解。制备1 5%的琼脂糖凝胶，加入DNA样品，以5V/cm的电压电泳1～2ｈ，紫外透射仪观察DNA条带，成像、照片。

　　2.2.2  凋亡及相关基因检测迅速分离心脏,常规石蜡包埋，切片数张。心肌细胞凋亡按末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞核的3’末端。分离MRL小鼠心脏，使用200℃干烤的器械于手术台上留取100 mg心室肌组织，迅速将组织置于4℃DEPC水中洗去血液后，置冻存管中保存于液氮中，M-Caspase 3基因按照相应的RT-PCR实验流程进行检测，引物序列依据文献报道设计，由上海生物工程公司合成，RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶（含GoldView染料）上电泳，120V，25min，用UVP凝胶图像成像系统拍摄打印实验结果，用凝胶图像分析系统（Gel-Pro Analyzer Version 3.0）分析结果。

　　2.3  图像分析用图像分析仪900倍放大凋亡和免疫组化切片，每张片随机取10个视野，测定阳性染色的平均吸光度与阳性细胞百分比，计算细胞凋亡指数(AI)。

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