HPLC法测定不同产地刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷含量(2)

　　2.2  对照品溶液的制备

    分别精密称取绿原酸和金丝桃苷对照品适量,加50%甲醇制成绿原酸(0.051 8 mg/mL)和金丝桃苷(0.051 mg/mL)的混合对照溶液,即得。

　　2.3  供试品溶液的制备

    取刺五加叶粗粉(过2号筛)0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%乙醇20 mL,称定质量,超声处理30 min,放冷,再称定质量,用50%乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,精密移取续滤液1 mL置5 mL棕色容量瓶中,50%甲醇定容,即得。

　　2.4  线性关系考察

    精密称取绿原酸对照品10.2 mg和金丝桃苷对照品10.36 mg,置10 mL棕色容量瓶中,加50%甲醇溶解并定容,摇匀,制成绿原酸(1.02 mg/mL)及金丝桃苷(1.036 mg/mL)的混合储备液。精密吸取此储备液0.1、0.2、0.5、0.8、1.5、3.0 mL,分别置10 mL棕色量瓶中,加50%甲醇定容,摇匀,制得系列对照品溶液。分别吸取10 μL,注入液相色谱仪,记录峰面积。以对照品溶液浓度(μg/mL)为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得绿原酸标准曲线回归方程为：Y＝6 923.6X＋15.995,r＝0.999 5,线性范围为10.2～306 μg/mL；金丝桃苷标准曲线回归方程为：Y＝20 133X－47.864,r＝0.999 8,线性范围为10.4～312 μg/mL。

　　2.5  精密度试验

    精密吸取绿原酸(0.051 mg/mL)和金丝桃苷(0.051 8 mg/mL)的混合对照品溶液,重复进样6次,每次10 μL,分别测定绿原酸和金丝桃苷的峰面积。结果绿原酸的RSD＝1.13%,金丝桃苷的RSD＝1.02%,精密度良好。

　　2.6  稳定性试验

    取同一产地刺五加叶(凤城)粗粉0.5 g,精密称定,按照“2.3”项下方法制备供试品溶液,室温下放置,分别于0、1、2、4、8、12 h进样10 μL,依法测定绿原酸和金丝桃苷的峰面积值。结果绿原酸和金丝桃苷的日内RSD分别为2.21%和1.07%,表明样品在制备供试品溶液后至少12 h内稳定。

　　2.7  重复性试验

    取同一产地刺五加叶(凤城)粗粉5份,每份约0.5 g,精密称定,照“2.3”项下方法制备供试品溶液,依法进行测定。结果绿原酸平均质量分数为3.79%,RSD＝1.93%；金丝桃苷为0.531%,RSD＝1.12%,表明本测定方法的重复性良好。

　　2.8  回收率试验

    精密称取同一产地已知含量的刺五加叶(凤城)粗粉6份,每份约0.25 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入含绿原酸4.8 mg/mL、金丝桃苷0.7 mg/mL的混合对照品溶液2 mL,制备供试品溶液,按上述高效液相色谱条件测定,计算。结果绿原酸和金丝桃苷的平均回收率分别为97.14%和98.21%,RSD分别为2.65%和1.89%。

　　2.9  样品测定

    分别精密称取8个产地刺五加叶粗粉各0.5 g,按上述方法测定,测定结果见表1。所测样品绿原酸含量为0.207%～4.600%,平均2.551%(n＝8)；金丝桃苷含量为0.206%～0.780%,平均0.499%(n＝8)。其中采自丹东刺五加基地的样品所含绿原酸及金丝桃苷均较高。表1  不同产地刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷含量测定结果（略）
 
　　3  讨论

　　3.1  流动相的优化

    比较了不同系统和流动相比例,如乙腈(A)-0.1%磷酸(B)梯度洗脱(0～50 min,A的体积分数为10%～20%；50～86 min,A的体积分数为20%～48%；86～135 min,A的体积分数为48%～100%)[1]、甲醇-0.4%磷酸(38∶62)[2]、磷酸溶液的比例经调试磷酸溶液(13∶87)[3],效果均不够理想。结果甲醇-0.4%磷酸(17∶83)系统绿原酸和金丝桃苷得到较好分离,且保留时间合适。

　　3.2  检测波长的选择

    文献报道绿原酸在327 nm处有最大吸收[2],金丝桃苷在257 nm和360 nm波长处有最大吸收[4]。通过试验比较,在360 nm处绿原酸和金丝桃苷的峰面积值较理想,故选择360 nm为2个成分的同一检测波长。

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