1.3 NO浓度测定
细胞加入刺激物后培养24 h，收集各处理组细胞培养上清液，用硝酸还原酶法检测炎性介质NO的浓度。操作步骤按试剂盒说明书完成。
1.4 细胞因子浓度测定
细胞加入刺激物后继续培养24 h，收集各处理组细胞培养上清液，用TNFα和IL6 Elisa试剂盒检测上清液中细胞因子的含量。操作步骤按试剂盒说明书完成。
1.5 统计分析
所有数据以±s表示，采用SPSS 11.0统计软件对实验结果进行Student’s t检验，P<0.05 为差异有显著性。
2 结果
2.1 穿心莲内酯对LPS诱导巨噬细胞NO生成的影响
收集24 h细胞培养上清，用Griess法测定细胞上清中NO 的含量。结果见表1。结果显示，50 μmol/L穿心莲内酯单独作用并不影响巨噬细胞NO的表达(与正常对照组比较，P>0.05);1 μg/mL LPS刺激可以显著诱导巨噬细胞RAW 264.7产生NO，而穿心莲内酯预干预能明显抑制LPS引起的NO的释放，并在1～50 μmol/L浓度范围内呈剂量依赖性。表1 穿心莲内酯对NO分泌的影响
2.2 穿心莲内酯对LPS诱导巨噬细胞TNFα、IL6生成的影响
结果见表2。Elisa检测结果显示，在正常情况下巨噬细胞RAW264.7培养上清中TNFα、IL6含量极低，50 μmol/L浓度的穿心莲内酯单独作用对其表达也无明显影响(与正常对照组比较，P>0.05)。当用1 μg/mL LPS刺激后，巨噬细胞TNFα和IL6的表达均明显增高，与正常对照组比较，P<0.01。用穿心莲内酯预处理能够抑制LPS诱导的炎症反应，穿心莲内酯各处理组TNFα、IL6浓度均明显低于LPS组，两者比较差异有显著性。
3 讨论
近年来，炎症在多种疾病中，尤其是心血管疾病和肿瘤中的作用引起了广泛的关注。根据在动脉粥样硬化斑块有多种炎性细胞和炎症因子存在等证据，Ross明确提出了动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的“炎症学说”，指出慢性炎症反应是AS的主要发病机制[4]。随后的研究证实，进入血管壁的巨噬细胞可被氧化型低密度脂蛋白、革兰阴性菌及其LPS活化，通过NFκB、iNOS和COX等途径产生TNFα、IL6、NO、PGs等多种炎症介质，促进AS斑块的形成和发展，而抑制炎症反应可改善AS病变程度，进一步说明了炎症在AS中的关键性作用[5]。炎症与肿瘤的关系很早就引起了人们的关注。现代研究认为，炎症细胞主要通过分泌IL1、IL6、TNFα、NO、PGs及活性氧等炎症因子，参与组成肿瘤微环境，影响肿瘤的进程。这些炎症因子不仅能诱导正常细胞的恶性病变，还可以促进肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡，诱导肿瘤血管形成，在肿瘤发生发展中有重要作用[6]。2009年，Mantovani在Nature杂志上提出，与无限制性生长、转移等特征一样，炎症性微环境与肿瘤关系密切，并认为炎症是肿瘤的7大重要标志之一[2]。 表2 穿心莲内酯对TNFα和IL6表达的影响
与正常对照组比较：**P<0.01;与LPS组比较：#P<0.05，##P<0.01 目前，国内外研究者都在积极寻找抗炎药物，对心血管疾病和肿瘤进行防治研究工作[1,7-8]。我国传统中药，尤其是清热解毒中药很多具有抗炎作用，发挥中药资源在抗炎症方面的优势，寻找有效的抗炎中药，防治危害人类健康的重大疾病是中药现代化开发的需要。穿心莲内酯是清热解毒代表中药穿心莲的主要药效成分。以往研究证实，穿心莲内酯有显著的抗炎活性，能抑制二甲苯和醋酸所致的小鼠毛细血管通透性增加，还对大鼠蛋清蛋白、角叉菜胶足趾注射致炎模型有明显的抗炎作用[3]，但对其细胞及分子机制并不清楚。本研究以穿心莲内酯为研究对象，初步观察了其对炎症因子NO、TNFα和IL6表达的影响。实验结果显示，LPS刺激可以诱导巨噬细胞大量表达炎症因子NO、TNFα和IL6，而穿心莲内酯预处理则可以减轻LPS引起的炎症反应，减少巨噬细胞炎症因子的表达。有研究显示穿心莲内酯可以阻碍NFκB与DNA的结合，抑制NFκB下游基因的转录[9]。iNOS、TNFα、IL6等基因的表达都受到NFκB的调控，因此推测穿心莲内酯抑制炎症因子表达可能与降低NFκB信号分子活性有关。本研究结果显示，穿心莲内酯能降低LPS诱导的巨噬细胞炎症因子NO、TNFα和IL6生成，抑制炎症反应，为穿心莲内酯应用于动脉粥样硬化、肿瘤等炎症相关性疾病的治疗提供了理论基础。
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