栽培甘草群体中不同单株甘草酸的含量差异研究(2)

　　供含量测定用甘草酸铵(编号：110731)购自中国药品生物制品检定所;CALEDON色谱纯乙腈;分析纯甲醇、甲酸、磷酸;市售的娃哈哈纯净水。

　　2 方法

　　2.1 色谱条件色谱柱为DIKMA Diamonsil-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5μm)和Daiso-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，UnimicroTechnologies. Inc. 公司);柱温25℃;流动相A为0.1%磷酸水溶液，B为乙腈;梯度程序、流速及检测波长变化见表1。甘草酸色谱峰理论塔板数为16万。进样10 μl。以上方法为建立甘草指纹图谱所使用的条件，本文主要报道利用该方法测定甘草酸的结果[3] 。表1 色谱梯度洗脱溶剂和检测波长的时间程序流动相由磷酸(A)，乙腈(B)组成

　　2.2 供试液的制备 精称甘草粉末(60℃干燥12 h，粉碎过60目筛)0.1 g，于25 ml容量瓶中，加入近25 ml 67%甲醇冷浸24 h，超声30 min，放冷到室温，加提取液至刻度，摇匀后过0.45 μm滤膜，取续滤液备用。

　　2.3 线性关系考察 精密称取对照品甘草酸铵10.75 mg，用甲醇定容于25ml容量瓶中，作为对照品储备液。量取甘草酸铵储备液0.100，0.400，0.800，1.200，1.600，2.400，3.000 ml于7个5 ml容量瓶中，用甲醇定容到刻度，作为标准系列。进样10μl。以峰面积对甘草酸铵进样量(μg)作回归方程：A=1.024×103X+123.32，r=0.999 9。甘草酸铵盐在0.688～2.58 μg范围内呈良好线形关系。以甘草酸铵盐对照品0.2 mg折合甘草酸0.195 9 mg计算甘草酸含量。对照品及样品色谱图见图1。

　　a：对照品甘草苷(tR15.8)、甘草酸(tR36.0)。b：甘草主根样品

　　图1 甘草指纹图谱

　　2.4 精密度实验取标准系列6号，进样5次，甘草酸峰面积RSD为0.9%。

　　2.5 加样回收率 实验以重复性实验所得甘草酸平均含量为样品含量，精密称取样品5份，加入等量对照品溶液，按样品测定方法操作，计算甘草酸回收率102.6%，RSD为1.2%。

　　2.6 重复性实验取样品5份，按供试品的制备方法制备样品，记录甘草酸的峰面积，计算含量，RSD为1.6%。

　　2.7 稳定性实验按“2.3”项取样品1份，室温放置，0，2，4，6，8，10，24，32，54 h进样，记录甘草酸峰面积，峰面积有一定波动，但无明显变化趋势，计算甘草酸含量RSD为2.7%。

　　3 结果

　　根据上述方法，对100个单株甘草的主根中的甘草酸含量进行了测定。结果见表2。表2 不同单株甘草甘草酸含量“-”为样品损失未测;由于部分样品损失，实际只测得92株样品

　　4 讨论

　　4.1 遗传因素是导致相同栽培环境下的甘草群体中存在甘草酸含量变异的主要因素如表2所示，随机筛选的同一地块相同生长年限的100棵甘草植株中，其中甘草酸含量最高的个体达到4.941%，含量最低的只有1.201%，平均值为2.421%，RSD为27.77%。结果表明，相同栽培条件下甘草单株间甘草酸含量存在差异(RSD值远远大于3%)，在剔除了环境影响的因素后，导致甘草酸含量差异的原因应归结为种源的差异。这种差异可能是因为甘草为克隆植物，其新个体的产生不会发生基因的变化，突变的基因能够较长时间地保留，而不像依靠种子繁殖的植物一样，不断发生基因的交流，使突变在个体间交流，因此能在甘草等克隆植物中能检测到更多的基因变异，而栽培甘草群体的种子来源于野生甘草，实际是野生甘草群体的随机取样，这是栽培群体中不同个体间的甘草酸含量产生差异的主要原因。

　　4.2 高低含量组甘草酸含量差异显著，为直接以甘草酸为指标选育甘草优良品种提供了依据按照《中国药典》规定的2%标准，我们把样品分成两组，高于2%的高含量组和低于2%的低含量组，利用SAS软件对两组甘草酸含量进行统计分析，经过Wilcoxon 2检验，α=0.05，P<0.000 1,差异性显著。

　　随机筛选的栽培甘草可以被分成甘草酸含量具有显著性差异的高含量组和低含量组，说明相同环境下甘草酸含量变异很大，则可以在高含量组中选取优良单株，以甘草酸为指标选育甘草优良品种。

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