正交设计法优化川木通RAPD-PCR体系研究(2)

　　3  结果

　　3.1  电泳结果评分按照表2设计的16个处理进行PCR反应后，产物进行电泳。结果见图1。
   
　　根据电泳结果，按照本实验目的，即以后将要进行的遗传多样性分析的要求将16个处理从高到低依次打分，条带数量越丰富、清晰度越高、背景低的最佳产物记为16分，与此相反，最差的记为1分［7,8］。两次重复分别独立设计，从两次重复的结果看，各个处理组合的反应都具有较高的一致性。两次记分分别为1，13，14，11，10，16，15，12，2，9，8，7，6，5，4，3和1，12，14，13，10，16，11，15，2，8，9，7，5，6，4，3。

　　3.2  各因素对PCR反应影响的差异分析将上述处理结果用统计软件MINITAB(Minitab Inc.)进行方差分析。结果见表3。由F值可见，Taq 酶的影响最大，模板的影响最小，各因素对PCR反应的影响由大到小依次为：Taq 酶、引物、Mg2+、dNTP、模板。由于各因素水平间的差异均达到显著水平，可以进一步进行因素内多重分析。表3  PCR反应各因素间方差分析（略）

　　3.3  因素内各水平对PCR结果的影响为了分析各因素的最佳反应水平，在方差分析的基础上，继续对每个因素各个水平作多重比较，评价结果如下。
   
　　Taq酶的0.1与0.2，0.3与0.4水平差异不显著，其余组合差异显著。由于Taq酶对结果影响最大，0.3与0.4水平达到了反应的最佳效果，且水平间差异不明显，从经济角度考虑选择了0.3水平为最佳反应水平。

    Mg2+浓度对PCR结果影响明显，较为敏感，2.5水平表现最好，选择2.5水平作为本实验的最佳反应水平。

    模板DNA浓度在本实验梯度内无明显变化，本实验选择1作为标准。

    dNTP浓度对PCR反应结果影响具有明显的规律，在1～2水平上效果较好，其它高浓度效果较差。最终选择dNTP最佳水平为2。
   
　　引物浓度最佳水平最终选择1。

    退火温度进行梯度实验后最终选择36℃。

    最终，RAPD-PCR反应的条件确定为：20μl体系，其中含1×PCR buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTPs，1.0 U Taq 酶，0.5 μmol/L 10-mer引物，50ng模板DNA，补ddH2O至终体积20 μl。PCR反应热循环程序如下：95℃预变性5 min；36℃复性1 min；72℃延伸1.5 min；94℃变性1 min；36℃复性1 min；72℃延伸1.5 min，35个循环。最后72℃延伸10 min，反应产物在4℃保存。

　　4  讨论

    本实验借助正交设计优化PCR反应体系，使结果较以往的单因素实验更加科学、完善和简便，为以后的分子鉴定工作的标准化、高重复性奠定了基础。本方法在其它PCR类体系的设计优化上有一定的指导作用和示范意义。

【参考文献】
  1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(28卷)［M］.北京:科学出版社,1980:177.

　　［2］黎裕，贾继增，王天宇. 分子标记的种类及其发展［J］. 生物技术通报,1999,4:19.

　　［3］干滟，曾凡亚，赵云，等.油菜单株总DNA的快速制备［J］.四川大学学报(自然科学版),1999,36(5):936.

　　［4］谢运海，夏德安，姜静，等.利用正交设计优化水曲柳ISSR-PCR反应体系［J］.分子植物育种,2005,3(3):445.

　　［5］Bautista R, Crespillo R, Francisco MC ，et al. Identification of olive-tree cultivars with SCAR markers［J］. Euphytica，2002, 129: 33.

　　［6］Jia JH, Wang P, Jin DM, et al. The application of RAPD markers in diversity detection and variety identification of Porphyra［J］. ACTA Bot Sin，2000,42: 403.

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