RPMI-1640培养基的配制：将10.4 g RPMI-1640和34.53 g MOPS粉末溶于900 mL蒸馏水中,用1 mol/L NaOH溶液调整其pH至7.0(25 ℃),加蒸馏水定容至1 L,G-6漏斗滤过灭菌,存于4 ℃冰箱备用。
SDA培养基的配制：称取PDA 粉末67 g,加入1 000 mL蒸馏水,摇匀加热煮沸溶解,121 ℃高压灭菌20 min,分装,4 ℃保存,备用。
1.4 仪器
BHC-1300ⅡA型生物安全柜,苏州安泰空气技术有限公司;FMspx-250B型生化培养箱,上海福玛试验设备有限公司;Leica DM-2500型显微镜,德国。
1.5 地锦草不同部位的提取分离方法
取地锦草全草10 kg,粉碎,加70%乙醇回流提取2次(8、6倍),每次2 h,药渣加水煎煮提取1次(10倍,2 h),分别滤过,合并醇提液,减压回收至流浸膏状(相对密度1.1,热测),另水提液减压回收至流浸膏状(状态同上)。合并以上醇提及水提浸膏(体积约5～10 L,若粘稠可加水稀释),依次用石油醚、氯仿、正丁醇萃取,每种有机溶剂萃取5次,合并有机溶剂萃取液,分别将各有机溶剂萃取液及萃取后的水相减压回收至干,分别得到石油醚、氯仿、正丁醇及水相4个溶剂萃取部位,称重,粉碎,即得。
1.6 最低抑菌浓度测定
根据NCCLS推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)[4],测定地锦草不同萃取部位对23株皮肤癣菌的最低抑菌浓度值(MIC)。
1.6.1 抗真菌药物储备液、稀释液的制备 称取地锦草各萃取部位分别为204.8 mg,用1 mL二甲基亚砜(DMSO)溶解,制成浓度为204 800 μg/mL的储备液,存于-20 ℃冰箱备用;称取TBF 8 mg,用1 mL DMSO溶解,制成浓度为8 000 μg/mL的储备液。从中吸取1 μL加RPMI-1640培养基499 μL,使之稀释500倍,此时,TBF储存液浓度为16 μg/mL,存于-20 ℃冰箱备用。
将地锦草各萃取部位储备液、TBF储备液分别用RPMI-1640培养基倍比稀释成2倍终浓度。地锦草的2倍终浓度由高到低依次为：2 048、1 024、512、256、128、64、32、16、8、4 μg/mL;TBF的2倍终浓度由高到低依次为：0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25、0.000 625、0.000 312 5 μg/mL。
1.6.2 菌接种液的制备 ①皮肤癣菌：将受试的皮肤癣菌接种于SDA上,26 ℃培养7～14 d。吸取2 mL无菌的0.85%NaCl溶液,冲洗菌落表面的菌丝和孢子,将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板记数,将其浓度调至0.4×106～5×106 cfu/mL之间,用RPMI-1640培养基稀释50倍至2倍终浓度。②念珠菌：将受试的念珠菌接种于SDA上,36 ℃培养48 h。挑取菌落,加入2 mL无菌的0.85% NaCl溶液中,用0.5# McFarland standard比浊管比浊,用RPMI-1640液基稀释100倍后再稀释20倍至2倍终浓度。
1.6.3 接种 将100 μL的2倍终浓度的药液,由第1孔至第10孔分别由高浓度到低浓度加入无菌96孔细胞培养板中,第11孔为生长对照孔(仅加菌悬液100 μL和RPMI-1640培养基100 μL,不加药物),第12孔为空白对照孔(真菌、药物都不加,只加RPMI-1640培养基200 μL)。将调好的菌接种液100 μL,分别加入相应的微孔内,这将使每一梯度的抗真菌药物和菌接种液(2倍终浓度)分别被1∶1稀释到终浓度。
1.6.4 结果判定 皮肤癣菌,26 ℃孵育7～14 d读结果。念珠菌,36 ℃孵育48 h读结果。读取MIC值时,应在不搅动的情况下与对照孔按下列标准比较。0：肉眼清晰;1：略模糊(80%受抑制);2：浊度显著减低(50%受抑制);3：浊度轻度减低;4：浊度未减低。本试验药物取1或2为判定终点。
1.6.5 质量控制 按照NCCLS方案,对近平滑念珠菌XYZ 5001进行反复测定,其两性霉素B的MIC值0.5～4.0 μg/mL,氟康唑的MIC值1.0～4.0 μg/mL,5-氟胞嘧啶的MIC值0.12～0.5 μg/mL。
每次试验以此菌株为对照,只有当其MIC值介于其质控范围之内时,方认为试验操作准确可靠。且只有当生长对照孔生长良好,空白对照无生长,其他孔随药物浓度升高,呈现真菌生长梯度受抑制时,方证明试验成功。
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