强精煎抑制实验小鼠睾丸生精细胞凋亡的机制研究(2)

　　2.2 睾丸组织病理形态的观察将已经用石蜡包埋的睾丸标本切成厚约4 μm的连续石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察其病理形态，采用Johnson 评分法[4]评价精子发生和精子发生障碍的程度。生精功能正常为10分;各期生精细胞存在，但排列紊乱为9分;生精小管中有少量精子(5～10个) 为8分;无精子，但有许多精子细胞为7分;无精子，仅有少量精子细胞(5～10个)为6分;无精子，但有许多精母细胞为5分;无精子细胞，仅有个别精母细胞(<5个)为4分;仅有精原细胞为3分;无生精细胞，仅有支持细胞的为2分;管腔内无细胞为1分。评分越高精子发生越好，反之，精子发生障碍程度越严重。

　　2.3 睾丸组织Fas及Fasl蛋白表达情况的检测严格按照博士德公司所提供的免疫组化SABC法操作步骤分别检测Fas和Fasl，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知的阳性组织作为阳性对照。镜检睾丸组织细胞膜或细胞质内出现棕黄色或棕色染色为阳性细胞。在高倍镜下(400×) 随机检测5个视野，计算500～1 000个细胞中阳性细胞所占的百分比。

　　2.4 统计学处理方法参数统计用方差分析，q检验;非参数统计用秩和检验。全部实验数据用PEMS3.1统计软件处理，作相关统计分析。

　　3 结果

　　3.1 病理形态观察结果因操作不当，于造模开始至第1周先后有8只小鼠死亡。各组的Johnson评分比较见表1。因正常组数据不符合正态性分布，故采用成组设计多组秩和两两比较的q检验法检验。

　　3.2 Fas 和Fasl蛋白表达率的检测结果见表2。Fas各组采用秩和检验;Fasl各组采用方差分析，组间比较F=10.026。表1 4组小鼠睾丸病理形态的Johnson评分比较表2 各组小鼠睾丸 Fas蛋白表达率的比较与正常组比较，◇P<0.05，◇◇P<0.01;与模型组比较，◆P<0.05，◆◆P<0.01;与黄精赞育胶囊组比较，*P<0.05，**P<0.01;n=18

　　各组的间质细胞、支持细胞、各级生精细胞及精子均可见Fas和Fasl蛋白的阳性表达。Fas多表达在精母细胞、精子及其周围残留胞浆中，Fasl多表达在间质区。

　　3.3 病理损伤程度与Fas及Fasl蛋白表达率的关系见表3。表3 72例小鼠睾丸病理损伤程度、Fas和Fasl蛋白表达率间的Pearson相关系数

　　4 讨论

　　生精细胞过度凋亡是造成睾丸生精功能障碍的直接原因。以往的研究表明，以补肾健脾为主要功效的经验方强精煎具有修复睾丸病理损伤，降低睾丸生精细胞凋亡率的作用，临床治疗少弱精子症可以有效改善精子质量 [2,5,6]。本次研究也显示，腹腔注射环磷酰胺后，模型组小鼠睾丸Johnson评分较正常组明显偏低，而给予强精煎灌胃的治疗组Johnson评分则较模型组有明显改善，与之前的研究相符。

　　生精细胞凋亡有多种调节机制，其中胱门蛋白酶在生精小管凋亡调控中具有核心作用，其中涉及死亡受体Fas及其配体 Fasl的信号通路是哺乳动物生精细胞凋亡通过胱门蛋白酶的主要途径之一。该通路又称为外源性通路，Fas为一个单跨膜受体蛋白，属于肿瘤坏死因子受体/神经生长因子受体家族，当其与之配体Fasl结合后可导致 Fas 三聚化，后者通过死亡结构域(DD)与Fas-相关死亡结构域(FADD)结合。FADD的N-末端还包括死亡效应结构域( DED )。Fas/ FADD复合物随后通过 FADD 上的 DED 与胱门蛋白酶原8或 10 结合，并激活后者，从而启动分解信号并导致细胞解体[7]。国内研究证实[8]，Fas及Fasl系统确实可以介导生精细胞的过度凋亡，引起生精功能障碍，并且其定位不只局限在生精小管内，亦可能发生在间质细胞中。本次实验也观察到，模型组各级生精细胞和支持细胞及间质细胞都可见Fas和Fasl的高表达，且Fasl多表达在间质区，Fas多表达在生精细胞。同时，统计显示，所有小鼠睾丸Johnson评分总体与Fas和Fasl的表达率间分别呈负相关性，说明Fas和Fasl系统可能在环磷酰胺所致的小鼠生精细胞过度凋亡中发挥着重要作用，而且靶点较为广泛。组间比较显示，强精煎组Johnson评分和Fas及Fasl表达率与正常组和黄精赞育胶囊组无明显区别，但与模型组区别显著，说明强精煎同黄精赞育胶囊一样，可以下调Fas和Fasl在丸组织中的表达，这可能是其降低生精细胞凋亡率，修复组织损伤，改善受损的生精功能的分子机制之一。

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