大鼠足垫皮肤石蜡切片制作体会(2)

二甲苯的更换需根据实际情况定，因为频繁更换可能导致第一缸的二甲苯浓度过高使标本变脆，影响后期超薄切片的制作；长时间不更换又可能影响透明效果，染色后可能出现黑色沉淀。我们的经验是，一旦观察到二甲苯变浑浊，即将第二缸换到第一缸，只更新第二缸，必要时在第一缸中加入少许的无水乙醇，以保护组织。         3浸蜡和包埋
        3.1浸蜡:皮肤标本比较脆且硬，切片制作难度比较大，因此，浸蜡是否完全直接影响蜡块制作的成功与否，我们长期摸索的经验是慢工出细活，要分三缸浸蜡，慢慢除去标本中的二甲苯，使蜡完全渗透。其步骤如下：石蜡Ⅰ(50%石蜡+50%二甲苯)1h，石蜡Ⅱ1h，石蜡Ⅲ2h。温度严格控制在64℃～66℃。更换蜡缸时应尽量不要将组织内含有的二甲苯带到下一缸蜡中去。
        3.2包埋:包埋用的石蜡要新鲜，不含杂质。为能更好地观察足垫皮肤全层的组织结构，包埋前需先将组织块剪成4-5小块，包埋时统一将剪切面竖着包埋，这样切片时才能观察到皮肤的纵切面。这里有一个小技巧：在包埋器内先注入少许溶化的蜡，待蜡在半凝的状态下，用镊子迅速夹起需要包埋的组织，像插秧一样插进半凝的蜡中，这样既能保证剪切面能立起来，又能避免碰倒已排好的组织，组织排好后再加入足量的蜡。
        组织块的保存也有一定的技巧。像南方空气湿度比较大，蜡块容易被虫蛀，故少量的标本或非常重要的蜡块一般置于4℃冰箱保存，但对于我们这些动辄上百个且需要分类保存的标本放冰箱很占用空间。我们采用切片盒或空纸盒分类标记，然后用整理箱的保持的方法效果非常好，遇到春天空气湿度非常高时再放一些吸湿包，这样的保持方式已延续8年，蜡块仍完好。
        4切片
        切片前先把蜡块放在冷冻台或4℃冰箱中冷冻15分钟再固定在持蜡器上，调整好切片刀与蜡块的距离，调整切片厚度一般厚度为3-5μm。先进行修片修完片后重新把蜡块放入冷冻台或-20℃冰箱中冷冻15分钟再进行切片。连续旋转转轮会切出一条连续的蜡带，左手用毛笔将蜡带轻轻托起，牵引蜡带向前拉，至一定长度后用镊子和毛笔将蜡带取下放在44℃水中摊平再捞片。捞片位置以中间为好。切片的速度要快，摊捞片时间不能太长以免角质层与皮下组织分离。用于普通组织学检查的石蜡切片的厚度一般为4～10μm，而该厚度的切片用于做免疫组化时常出现脱片现象，经调整蜡片厚度至2～3μm后组织脱落现象大大减少，但皮肤的超薄切片对操作者要求比较个高，需要长时间的练习才能完成。
        5讨论
        石蜡切片制作方法是科研中最常用的研究方法之一，看似简单，但要针对自己的标本做出一张完美的切片仍然需要长时间的摸索，尤其对于一些复杂的标本，如本文所用的大鼠足垫皮肤，还有一些如软骨等特殊的组织，都需要不同的处理程序以达到最佳的效果。而且，石蜡切片的制作是一个连续的流程，需要操作者熟悉每一个步骤的意义及可能的结果，才能随时调整实验方案。其次，操作者还需要有认真负责的态度，严格控制每个步骤的时间，这样做不但保证蜡块的质量，也保证所有的实验条件都相同，使最终一些要求定性、定量的实验结果可信度高。此外，许多初学者都是拿着别人的实验流程就埋头往下做，严格按照流程往往需要半夜更换脱水剂，或者遇到这种情况时随意更改实验流程，往往影响最终的实验结果。我们的经验是每次都将取材固定的时间控制在上午10点，然后固定到当天下午2点，冲水至第2天下午2点，50%酒精脱水至5点换75%酒精过夜，这样的流程刚好将整个实验时间控制在上班时间段，避免休息时间的实验操作，对于工作量很大的科研者而言，时间安排是非常重要的。

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