石斛不同种、不同药用部位中多糖含量测定(2)

　　1  材料与仪器

　　1.1  仪器UV一752分光光度计(上海第三分析仪器厂)；SHB-3循环多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）；hh-2数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；hctp11b5托盘天平（北京医用天平厂）；正德牌远红外可控调温电炉（成都市聚焱电器厂）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

　　1.2  药材石斛药材收集于云南各地、四川夹江县歇马乡及成都五块石药材市场，所有药材均经刘圆教授鉴定。见表1。表1  不同品种石斛采集地点及日期（略）
　
　　2  方法与结果

　　2.1  多糖的提取与精制称取各石斛药材粉末（过2号筛）100 g，精密称定，分别至圆底烧瓶中，各加入石油醚（60～90℃) 400 ml，脱脂30 min，过滤，通风橱中挥去溶剂。滤渣以80 ％乙醇100 ml回流提取30 min，趁热过滤。滤渣用80 ％热乙醇充分洗涤，再于通风橱中挥去溶剂。取各残渣分别再用 500 ml蒸馏水回流2 h，提取3次，趁热过滤，用热水洗涤药渣和烧瓶，合并滤液。滤液浓缩至150 ml，加入等容积的 sevag试剂 (按正丁醇∶氯仿=4∶1配制而成)，分液漏斗萃取。取上层液体，反复操作。紫外分光光度计扫描，无蛋白吸收峰。逐滴加入乙醇(95％)至整个溶液中含醇量达到80％，滴加过程中用磁力搅拌器搅拌，静置过夜。抽滤，沉淀用无水乙醇反复洗涤，60℃真空干燥，得各石斛精制多糖，封装备用［5～7］。

　　2.2  对照品溶液的制备称取葡萄糖约0.08 g于小烧杯中，精密称定，用蒸馏水溶解后，移至100 ml棕色容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，得对照品溶液。

　　2.3  标准曲线的制备精密取葡萄糖标准液1，1.5，2，2.5 ，3，3.5 ml，分别置50 ml棕色容量瓶中，各加蒸馏水至刻度。精密量取上述各浓度的标准溶液0.5 ml于10 ml棕色容量瓶中，各精密加入5 %苯酚溶液1.0 ml，摇匀，迅速加入5.0 ml浓硫酸，在沸水浴中加热20 min，冷却至室温。在波长490 nm下测定吸光度，同时做一空白，以标准溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。对所测数据采用回归法计算出标准曲线的回归方程为Y=4.994 9X－0.025 2（r=0.999 4）,结果表明在0.016 ～0.294 mg/ml之间，葡萄糖浓度与吸光度值具有良好的线性关系。

　　2.4  稳定性实验取葡萄糖标准液0.5 ml，置10 ml容量瓶中，按标准曲线制备项下的方法，自“加入5 %苯酚溶液1 ml”起，依法每隔0.5 h测定吸光度值，连续4 h，结果吸光度基本无变化，样品溶液的稳定性良好。

　　2.5  精密度实验精密量取葡萄糖标准溶液0.5 ml，置10 ml容量瓶中，按标准曲线制备项下的方法，自“加入5 %苯酚溶液1 ml”起，依法重复测定吸光度，RSD为1.06 %（n=6）。结果表明精密度良好。

　　2.6  加样回收率实验分别取相应石斛粉末各 0.25 g，分别精密加人葡萄糖储备液适量，按样品制备和含量测定方法测定，平均回收率 98.62 ％，RSD为 1.27 ％（n=9），符合测定要求。

　　2.7  换算因子的实验称取 6O ℃干燥至恒重的相应石斛多糖各10 mg，精密称定。分别配制成0.1 mg／ml溶液。各取 0.5 ml按标准曲线的制备方法，测定吸收度，另取葡萄糖标准液，同法操作，求出相应石斛中葡萄糖浓度，按下列公式计算换算因素11种石斛多糖换算因子。

　　f=多糖重量／(多糖液的葡萄糖浓度 ×多糖的稀释因素)

　　2.8  不同种、不同药用部位多糖的含量测定精密称取 60℃恒重的上述石斛茎粉末（过2号筛）各0.5 g,精密称定，分别置圆底烧瓶中，加入石油醚 (60～90℃)5.0 ml，脱脂30 min，过滤，通风橱中挥去溶剂。滤渣以80 ％乙醇100 ml回流提取30 min，趁热过滤。滤渣用80 ％热乙醇充分洗涤，再于通风橱中挥去溶剂。取残渣再用 100 ml蒸馏水回流2 h，提取3次，趁热过滤，用热水洗涤药渣和烧瓶，合并滤液，冷却后在500 ml量瓶中蒸馏水定容。精取各石斛提取液0.5 ml，按照标准曲线项下操作，测定吸收度，按下列公式计算样品中的多糖含量，重复 6次，取平均值。结果见表2，3。表2  不同种石斛茎中多糖的含量（略）表3  4种石斛不同部位的多糖含量（略）

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