喇咕多糖对α-淀粉酶活性的抑制及其对糖尿病大鼠血糖影响的实验

【关键词】  喇咕多糖 α-淀粉酶活性 血糖

    糖尿病是临床常见病、多发病，并发症、致残率均较高，而且随着全球老龄化趋势的加剧，糖尿病的发病率还将逐年上升。植物提取物［1，2］降糖的研究已经得到国内外研究机构证实，且具有毒副作用小、疗效确切的优势。我们观察了喇咕多糖在体外对α-淀粉酶活性的抑制作用及其对糖尿病大鼠血糖的影响。

　　1   材料与仪器

　　1.1   喇咕多糖的制备［3］

　　取喇咕壳，用水洗净，于室温下在5％～6％HCl中搅拌浸渍24 h，过滤，收集滤渣，水洗后在3％～4％NaOH液(加少量肥皂)中热回流4～6 h，重复2次。滤饼经水洗，干燥即得粗制甲壳质。粗品在0.5％高锰酸钾中搅拌浸渍约1 h，水洗后在1％的草酸中于60～70℃搅拌30～40min，水洗、干燥即得白色精制甲壳质，将其投入50％NaOH 140℃加热2 h，离心，收集沉淀，水洗干燥即得白色喇咕壳聚糖。

　　1.2   动物

　　Wistar种成年大鼠，体重170～190g，雌雄各半,由同济医学院老年医学研究所实验动物中心提供。

　　1.3   仪器、试剂α-淀粉酶冻干粉（中国医药集团上海化学试剂公司，批号：F20021030）；麦芽糖（上海源聚生物科技有限公司，批号：030125）；3,5-二硝基水杨酸（中国医药集团上海化学试剂公司，批号：20030704）；阿卡波糖（中国北京拜耳医药保健有限公司出品，批号：00102903）；D-860（甲苯磺丁脲，江苏丹阳市药业有限责任公司出品，批号：0021056）；四氧嘧啶（购自美国Sigma公司，批号：73K1626）；AU-400全自动生化分析仪（本奥林巴林公司出品）；稳捷型血糖仪（美国强生公司提供）。称取3,5-二硝基水杨酸1.0 g，加入1 mmol·L-1氢氧化钠溶液20 ml超声处理30 min, 成乳白色混悬液，再加入50 ml蒸馏水,混匀即成黄色澄清液体，准确称量30.0 g酒石酸钾钠加入，振荡混匀，待酒石酸钾钠完全溶解后用蒸馏水定容至100 ml，盖紧瓶盖,勿使CO2 进入。

　　2  方法

　　2.1  样品活性的测定

　　7支试管编号，一支为对照管，另6支为测定管，对照管加入 0.2ml pH6.6 的0.2 mmol·L-1磷酸缓冲液,另6支试管分别加入浓度为0.001 6，0.008，0.04，0.2，1，5 mg·ml-1的喇咕多糖溶液（α-淀粉酶及喇咕多糖溶液均用0.2 mmol·L-1 PH6.6的磷酸缓冲液配制）；7支试管依次加入0.2ml α-淀粉酶溶液并及时混匀，各管同时放入37℃恒温水浴箱，分别加入37℃预热的淀粉液0.4ml，充分混匀立即放入37℃恒温水浴保温5 min，然后取出迅速加入0.8 ml的0.4mmol·L-1氢氧化钠溶液终止酶活性。以上实验分别设4组，将喇咕多糖与α-淀粉酶的反应时间设为10，20，30，40 min，同时本底基数的测定为喇咕多糖与α-淀粉酶反应时间定在10 min，反应后加入37℃预热的磷酸缓冲液0.4 ml代替淀粉液，其他步骤同样品的测定。

　　2.2  OD值的测定

　　样品及本底基数测定各管中溶液各1 ml，放入10ml刻度试管，再分别加入1 ml DNS试剂混匀，置沸水浴8 min后，室温下冷却15 min，用蒸馏水稀释至10ml并混匀，用721分光光度计于520 nm 处测吸光度即OD值。抑制率（%）= 1-（样品OD值-本底OD值）/ 对照管OD值。

　　2.3  设阳性对照即测定阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率

　　阿卡波糖溶液的浓度及抑制率的测定过程，与喇咕多糖抑制率的测定过程相同并同时进行，阿卡波糖溶液与α-淀粉酶反应时间定为25min，重复3次。

　　2.4  喇咕多糖对四氧嘧啶糖尿病大鼠模型的降糖作用   

　　按文献［4］方法造模，正常Wistar大鼠禁食12 h，按50mg·kg-1体重剂量尾静脉快速注射2.5 %四氧嘧啶生理盐水溶液。造模注射后96h尾静脉采血用强生稳捷血糖仪测定空腹血糖（取血前禁食12h），血糖高于11.1mmol·L-1视为造模成功。将其随机分为3组，每组11只，即造模组（Model）、喇咕多糖组（PP）、阳性对照组。另设正常对照组（Normal）不予造模注射。即日开始灌胃给药，1次/d，连续5 d。正常对照组和造模组给予生理盐水，阳性对照组给予D-860 100mg·kg-1，喇咕多糖组给予喇咕多糖200mg·kg-1，每组灌胃按体积均为每只2 ml/次。给药5 d并禁食10 h后眼眶采血葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖。然后，造模组及正常对照组灌胃7.5%（2ml）的淀粉糊精；多糖组灌胃7.5%淀粉糊精-200 mg·kg-1喇咕多糖混合物（2 ml）；阳性对照组灌2 ml 7.5% 淀粉糊精及100 mg·kg-1剂量的D-860混合物。测定给淀粉后0.5，1，2 h的血糖值，采血及测定方法同空腹血糖。

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