正常成人肝组织中BMP9读码框架的克隆

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【摘要】目的获得骨形态发生蛋白（BMP9）基因并进行基因读码框架的克隆。方法自正常成人肝组织提取总RNA，一步法RTPCR扩增BMP9，扩增产物经过胶回收及酶切后，克隆入高效真核表达质粒pcDNA4/HisMax，构建重组表达载体。结果 RTPCR扩增获得约1.3 kb大小的产物，经限制性酶切分析和DNA测序，证实为人BMP9基因的完整开放读码框架。重组载体表达读码序列正确。结论正常成人肝组织总RNA经一步法RTPCR，能够对BMP9基因的开放读码框架进行完整有效的筛选。BMP9开放读码框架的完整克隆为其在骨、内分泌和神经系统等多能作用的转基因实验研究提供了基础。
【关键词】骨形态发生蛋白质类重组真核表达载体逆转录聚合酶链反应
［ABSTRACT］ObjectiveTo clone BMP9 gene in adult liver tissue and construct recombinant eukaryotic expression vectors.MethodsTotal RNA was extracted from normal liver tissue of an adult, then open reading frame of BMP9 was cloned by onestep RTPCR. The PCR products (1.4 kb) were inserted into eukaryotic expression vector, pcDNA4/HisMax, to construct recombinant vector.ResultsAccording to restrictive analysis and DNA sequencing of recombinant vector, the open reading frame of BMP9 was identified and the insert in MCS was correct.ConclusionThe ORF of BMP9 gene can be screened effectively from total RNA of normal liver tissue by onestep RTPCR. The complete clone of ORF of BMP9 has provided the basis for multifunction gene transfer experiments in the fields of orthopedics, endocrinology and central nervous system.
    ［KEY WORDS］bone morphogenetic proteins; recombinant eukaryotic expression vector; reverse transcriptase polymerase chain reaction
    转化生长因子β(TGFβ)超家族在细胞生长和分化中具有重要作用。TGFβ超家族中的一个特殊亚族由骨形态发生蛋白(BMPs)组成。这些二聚体蛋白的特性是在皮下注射后具有诱导异位骨形成的能力[1]。目前在BMP亚家族中已发现40个以上成员，不同的BMP分子通过Ⅰ、Ⅱ型受体在哺乳类动物体内的不同系统发挥生理作用[2]。BMP9是BMPs亚家族的成员之一，人BMP9基因位于染色体10q11.23，其成熟肽段包括110个氨基酸。除具有成骨活性之外，BMP9还具有参与肝的糖代谢、影响神经系统胆碱合成和对造血干细胞双向调节的作用等。本研究利用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术筛选BMP9的全长读码框架，克隆入真核表达载体构建重组体，获得准确且高纯度的质粒载体，为BMP9转基因实验研究提供基础。现将结果报告如下。
    1 材料与方法
    1.1 标本来源
    收集正常成人外伤性肝破裂修复术中切除的破裂肝组织，DEPCPBS反复洗涤后备用。
    1.2 总RNA提取
    将肝组织反复剪碎后，使用QIAGEN公司生产的QIAamp RNA Blood Mini Kit 试剂盒，按操作手册步骤进行肝组织总RNA的提取。
    1.3 Onestep RTPCR扩增及PCR产物胶上回收
    根据人BMP9在GenBank中的序列设计能扩增BMP9完整开放读码框架的引物，并分别在上、下游引物5′端加入BamH Ⅰ 和Xba Ⅰ 酶切位点，上游引物：5′CTCGGATCCATGTGTCC TGGGGCACTGTGG3′，下游引物：5′CTCTCTAGACTACCTGCACCCACACTCTGC3′。RTPCR反应体系为50 μL，内含：5×QIAGEN OneStep RTPCR Buffer 10 μL；10 mmol/L dNTP 2 μL；5×QSolution 10 μL；上游引物（6 μmol/L） 5 μL；下游引物（6 μmol/L）

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