【摘要】 目的 探讨μ型阿片受体（MOR）和催产素受体（OTR）可否形成异源性受体二聚体。方法 采用免疫共沉淀(IP)和荧光共振能量转移(FRET)方法，检测在MOR和OTR质粒共转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和大鼠脑组织中是否存在MOR和OTR异源二聚体。结果 IP方法检测显示，在MOR和OTR质粒共转染CHO细胞及大鼠脑组织中可见MOR和OTR蛋白条带。MOR和OTR共转染CHO细胞FRET方法检测信号为阳性（FRET率均值为2.01）。结论 在MOR和OTR质粒共转染CHO细胞及大鼠脑组织中存在异源性MOR和OTR二聚体。
【关键词】 受体 阿片样 μ 受体 催产素 受体 G蛋白耦联
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the existance of heterodimers of μ opioid receptor (MOR) and oxytocin receptor (OTR). MethodsThe immunoprecipitation (IP) and fluorescence resonance energy transfer (FRET) were used to study the dimerization of MOR and OTR in the Chinese hamster ovary cells (CHO) cotransfected by MOR and OTR plasmid and in the rat brain tissue.ResultsThe bands of MOR and OTR were seen in the cotransfected CHO cells and rat brain tissue via IP test. The FRET signal was positive in the cotransfected CHO cells (average value of FRET rate was 2.01). ConclusionThe heterodimers of MOR and OTR exist in the cotransfected CHO cells and brain tissues.
［KEY WORDS］receptors, opioid, mu; receptors, oxytocin; receptors, Gprotein coupled
阿片受体存在着μ、κ和δ三种亚型阿片受体，并在体内广泛分布[1，2]。有关研究显示，吗啡可以抑制大鼠视上核和室旁核催产素的合成释放[3，4]。KUTLU等[5]在孕鼠脑中也发现了吗啡抑制催产素释放的作用。吗啡和催产素无论在结构还是受体后信号转导上都存在很大差异，吗啡是通过什么途径来影响催产素的合成释放？本文采用免疫共沉淀(IP)和荧光共振能量转移(FRET)方法来检测μ型阿片受体（MOR）和催产素受体（OTR）间是否可以形成异源性的受体二聚体，以期为进一步探讨吗啡抑制催产素合成与释放的机制提供分子学基础。
1 材料与方法
1.1 材料
实验所需质粒均由第二军医大学神经生物学教研室提供。MOR和OTR抗体由第二军医大学神经生物学教研室制备。脂质转染购自Qiagen公司。荧光抗体购自Rockland公司。蛋白A胶联珠购自Pharmacia公司。大鼠购自中国科学院动物中心。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养以含体积分数0.10胎牛血清的PRMI 1640为培养基，在37 ℃、含体积分数0.05二氧化碳的培养箱中培养。
1.2.2 转染 CHO细胞均匀分布在瓶底80%的面积时，用pcDNA3.1MOR、pcDNA3.1OTR质粒单转或双转CHO（MOROTRCHO）细胞，具体步骤按照脂质转染试剂操作说明进行。
1.2.3 免疫细胞荧光和IP检测 具体步骤参照分子克隆。
1.2.4 脑组织裂解 脑组织裂解方法参考MIKAELA等[6]的方法，大鼠脑组织在NP 40组织裂解液中行匀浆处理，低温超速离心30 min，取上清存于-70 ℃冰箱待用。
1.2.5 FRET CHO细胞接种于无菌玻片上，分5组进行质粒转染：共转pECFPN1和pEYFPN1组（阴性对照组），转染pECFPYFP组（阳性对照组），共转pECFPN1MOR和pEYFPN1OTR组（实验组），单转pECFPN1MOR组，单转pEYFPN1OTR组。荧光质粒瞬时转染48 h后将玻片置于三通道FRET荧光显微镜下, 应用成像软件Imageproplus version 5.0.1拍摄图像。参照DAVID的方法对FRET图像进行分析。
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