1.5 动物
SPF级近交系BALB/c小鼠，雄性，8～10周龄，体质量（20±2）g，由南方医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）20060015。
2 实验方法
2.1 连翘水提取物的制备
取连翘原药材（生药）300 g，加12倍蒸馏水3 600 mL煎煮1.5 h，滤过，再加入蒸馏水3 600 mL煎煮1.5 h，连续3次，合并煎煮液，减压浓缩，定容为1 g生药/mL，冰箱保存。此为连翘水提取物原液。实验时取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，用完全RPMI1640培养液稀释，使细胞培养时的终质量浓度分别为8，4，2，1，0.5，0.25 mg/mL（相当生药量）。
2.2 连翘水提取物各化学部位的制备
取连翘水提取物原液200 mL，依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯等进行萃取，剩余部位用φ=80%乙醇醇沉。分别得到石油醚部位FSⅠ、乙醚部位FSⅡ、乙酸乙酯部位FSⅢ、乙醇溶解部位FSⅣa和乙醇沉淀部位FSⅣb。实验时用完全RPMI1640培养基稀释（经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌），使得在细胞培养时，终质量浓度分别为8，4，2，1，0.5，0.25 mg/mL（相当生药量）。
2.3 实验分组
体外对小鼠S180肿瘤细胞增殖影响： 对照组（不加药组）、5FU组、连翘水提取物组（FSTE）、石油醚部位组（FSⅠ）、乙醚部位组（FSⅡ）、乙酸乙酯组（FSⅢ）乙醇溶解部位组（FSⅣa）、乙醇沉淀部位组（FSⅣb）。
体外对免疫细胞（小鼠脾细胞）增殖影响： 对照组（不加药组）、5FU组、连翘水提取物组（FSTE）、乙醇溶解部位组（FSⅣa）。
2.4 体外细胞增殖实验（MTT比色法）
2.4.1 小鼠S180细胞体外增殖实验 取冻存的S180细胞，经复苏培养，取对数生长期细胞，用RPMI1640完全培养基制成细胞悬液。调整上述细胞浓度为4.0×104个细胞/ mL,分别接种于96 孔板中100 μL，接种时用磁力搅拌器边搅拌边加样，培养24 h 后，分别加入上述6 种不同浓度的连翘水提取物各100 μL；空白对照孔仅含完全培养基，不含肿瘤细胞；实验对照孔仅含肿瘤细胞，不含任何药物；另设5FU对照孔（终质量浓度25 μg/mL）。每个浓度组及各对照组均设6个复孔。将培养板置于37 ℃、含5%CO2 饱和湿度的培养箱中培养48 h后检测。培养结束前4 h每孔加入MTT（5 mg/ mL）20 μL，继续培养4 h，将细胞转移置EP管中，离心弃上清液后，每管加入二甲基亚砜200 μL，溶解紫色化合物，溶解液再转移置相应的96孔板孔中，微型振荡器振荡10 min，充分溶解，用全自动酶标仪于570 nm 波长处测定吸光度（A值）。按如下公式计算细胞抑制百分率。
抑制率(%)＝［1-(实验组A值-空白组A值)(实验对照组A值-空白组A值)］×100%
连翘水提取物的石油醚部位（FSⅠ）、乙醚部位（FSⅡ）、乙酸乙酯（FSⅢ）、乙醇溶解部位（FSⅣa）和乙醇沉淀部位（FSⅣb）的肿瘤抑制实验与水提取物相同。
2.4.2 小鼠脾细胞体外增殖实验 根据小鼠S180细胞体外增殖实验结果，选取连翘水提取物、乙醇溶解部位（FSⅣa）进行小鼠脾细胞体外增殖抑制实验。
取小鼠1只，拉颈椎处死，无菌取出脾脏放入盛有小量RPMI1640完全培养基的培养皿中，用2块玻片挟持捻碎，移入离心管中，经200目尼龙布滤过，滤液离心（1 500 r/min）收集细胞，用RPMI1640完全培养基洗3遍，计数，用RPMI1640完全培养基配成8×106个细胞/mL脾细胞悬液，并在已经加好待试药物以及空白对照、实验对照和5FU对照的每孔（96孔板）中加入100 μL，使每孔总液量为200 μL，置于37 ℃、含5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，48 h后检测，其余方法与上述小鼠S180细胞体外增殖实验相同。
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