重组人生长激素对原发性肝癌术后Th1/Th2漂移影响(2)

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　　1.2 标本来源
　　所有病人均于术前和术后10 d采集肘静脉血4 mL,EDTAK2抗凝。
　　1.3 PBMC的提取
　　用淋巴细胞分离液离心分层法分离提取病人血标本中的PBMC。
　　1.4 PBMC总RNA的提取
　　异硫氰酸胍法提取PBMC中的总RNA。
　　1.5 聚合酶链反应(PCR)引物
　　4种细胞因子和βactin的引物序列见表1。均由上海博亚生物工程公司合成。
　　表1 RTPCR检测Th1/Th2相关细胞因子的引物序列细胞因子序列长度(bp)βactin5′TCATGTTTGAGACCTTCAACA3′ 3005′CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3′ IFNγ5′ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTT3′4945′GATGCTCTTCGACCTCGAAACAGCAT3′IL25′ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT3′4585′GTTAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC3′IL45′ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCT3′4565′CGAACACTTTGAATATTTCTCTCTCTCAT3′IL105′ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA3′2495′GTTTCGTATCTTCATTGTCAT3′
　　1.6 逆转录反应
　　MMLV逆转录酶购自美国GBCO公司。 5～10 μg总RNA加入5×buffer 4 μL，0.1 mol/L DDT 2 μL, MMLV 1 μL(200U), 4×dNTP(10 mmol/L,每种)1 μL，下游引物P2 (50 pmol/L)0.5 μL,总反应体积20 μL。37 ℃作用1 h后，95 ℃ 10 min灭活MMLV。
　　1.7 PCR反应
　　在20 μL的RT反应产物中，加入10×buffer10 μL，25 mmol/L氯化镁8 μL， 4×dNTP 1 μL，上游引物P1(50 pmol/L)0.5 μL，液体石蜡100 μL，95 ℃下5 min，然后加入TaqDNA聚合酶(106 U/L)2 μL。循环条件：94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃1 min，35个循环;最后72 ℃延长7 min。
　　1.8 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳及其图像分析
　　PCR产物在15 g/L的琼脂糖凝胶上电泳20～30 min。紫外线灯下观察并拍照。用美国Kodak凝胶分析系统检测其吸光度(A)值作为表达强度，以βactin为内参照。表达强度=细胞因子A值/βactin A值。

　　1.9 Th1/Th2平衡状况的判断
　　如果仅IFNγ 和(或) IL2表达，或者其表达强度比IL10 和(或) IL4的表达强度高，则为Th1状态;如果仅IL10 和(或) IL4表达，或者其表达强度比IFNγ 和(或) IL2的表达强度高，则为Th2状态。如果4种细胞因子均未表达或表达强度一致或类似，则为Th0状态。
　　1.10 统计学处理
　　采用PPMS 1.5 统计软件[2]进行统计处理。
　　2 结果
　　重组人生长激素组病人与单纯手术切除组术前Th1、Th2表达差异均无显著性(P>0.05)。两组术后第10天比较，差异有显著性(Uc=2.58，P<0.01)。见表2。
　　表2 两组不同时间Th1、Th2状况比较(例)组别标本采取时间nTh1Th2Th0单纯手术切除组术前201424术后10 d20947重组人生长激素组术前161024术后10 d161411
　　3 讨论
　　生长激素对儿童免疫功能有重要的调节作用。陈耀勇等以NK细胞、IL1α和IL2活性等指标，对去垂体大鼠及生长激素缺乏症(GHD)病儿在生长激素治疗前后的免疫指标进行了研究，发现去垂体大鼠NK细胞活性及IL1α和IL2活性均明显降低，外源性生长激素可使上述指标得到不同程度的恢复。GHD病儿NK细胞活性明显降低，经生长激素治疗3个月后恢复到正常水平， IL1α和IL2活性治疗后有逐渐增高的趋势。国内杨毅等研究则显示，儿童胸腺、淋巴结和外周血淋巴细胞都有生长激素合成细胞，认为生长激素对于影响和调节小儿免疫系统发育具有重要作用。生长激素对成年人免疫系统的调节也具有重要作用。正常人的胸腺和淋巴细胞上存在生长激素的结合位点，生长激素与之结合后可促进淋巴组织增生。研究显示，生长激素能影响T细胞的功能，并促使T细胞在胸腺中发育[3]。无论外源性或内源性生长激素均可使PHA激活的淋巴细胞IL2R、 IL2和IFNγ的表达增强，抗生长激素抗体可抵消这一作用，说明生长激素对淋巴细胞的功能具有重要的调节作用[4]。重组人生长激素可使危重病病人NK细胞活性增强，并提高CD4/CD8比率。由以上研究报道可以看出，重组人生长激素可增强机体的细胞免疫功能，NK细胞是Th1类细胞，IL2和IFNγ是Th1类细胞因子，因此，重组人生长激素可能促使机体向Th1状态偏移。

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