1.2.2 组织准备 用80 g/L水合氯醛按4 mL/kg腹腔注射麻醉动物，灌注固定取材，脑组织采用40 g/L多聚甲醛固定24 h，然后置200 g/L蔗糖冷冻保护溶液中，待脑组织沉底后再移入300 g/L蔗糖冷冻保护溶液中，行连续冠状冰冻切片，片厚为16 μm，载玻片预先用多聚赖氨酸处理，烤箱烤干后保存。
1.2.3 免疫组织化学染色 切片在空气中放置至室温后，用0.01 mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次，浸泡在体积分数为0.01的H2O2甲醇溶液中孵育30 min以除去内源性过氧化物酶。PBS冲洗3次后用体积分数0.015正常山羊血清37 ℃封闭30 min，用TH抗体(1∶5 000)孵育，并置于湿盒中于4 ℃冰箱内过夜。PBS冲洗后，用生物素化山羊抗鼠二抗工作液孵育30 min，PBS冲洗3次，用辣根酶标记的链酶卵白素工作液孵育30 min，PBS冲洗3次，用DAB试剂盒显色2 min，观察其反应。不加一抗的切片不显色[3]。
1.2.4 铁染色 组织切片处理同TH免疫组化染色，采用PBS冲洗3次后，将切片置于等量体积分数0.02的盐酸和20 g/L亚铁氰化钾的混合液中孵育30 min，PBS冲洗后浸泡在体积分数为0.01的H2O2甲醇溶液中孵育20 min以除去内源性过氧化物酶，DAB显色。
1.3 统计学处理
统计SN及VTA每个高倍视野(400倍)内的阳性细胞数目并取平均值。实验结果以均数±标准差表示。采用PPMS 1.5[4]软件进行统计学处理，两组之间均数的比较采用t检验。
2 结 果
2.1 免疫组化染色
高铁饮食组、正常对照组小鼠SN内TH阳性细胞数分别为27.86±1.07、40.14±1.68，高铁饮食组较正常对照组明显减少(t=16.31,P<0.001)。高铁饮食组、正常对照组小鼠VTA内TH阳性细胞数分别为56.01±1.63、59.50±6.14，两组比较差异无统计学意义(t=1.10,P>0.05)。见图1。
A、B：正常对照组SN、VTA 400倍视野TH阳性细胞数;C、D:高铁饮食组SN、VTA 400倍视野TH阳性细胞数。
图1 两组SN和VTA内TH阳性细胞数的变化
2.2 铁染色
高铁饮食组、正常对照组SN内铁染色阳性细胞数分别为34.03±2.68、15.17±2.32，高铁饮食组较正常对照组明显增多(t=13.01,P<0.001)。高铁饮食组、正常对照组小鼠VTA内铁染色阳性细胞数分别为3.51±1.05、2.33±1.03，两组比较差异无统计学意义(t=1.95,P>0.05)。
3 讨 论
PD的病理学特征为SN多巴胺能神经元的选择性缺失及路易小体的形成。PD病人多巴胺能神经元的退行性变化主要发生在SN，而VTA却极少累及[1]。本实验在高铁饮食动物模型上得到了一致的结果。高铁饮食动物SN内的TH阳性细胞数明显降低，而VTA内TH阳性细胞数则未见明显变化，但SN多巴胺能神经元选择性损伤的机制仍不是十分清楚。
已有文献报道，PD病人的SN铁水平明显升高[5]。一般认为，铁离子在多巴胺能神经元细胞内的损伤机制如下：多巴胺在单胺氧化酶B(MAOB)的作用下产生H2O2，Fe2+ 可与H2O2通过Fenton 反应,生成具有高度细胞毒作用的OH·(H2O2+Fe2+→OH·+ OH-+ Fe3+)[6];OH·可造成蛋白质、核酸和细胞膜的损伤, 从而造成细胞的死亡[7]。PD的另一病理特征是路易小体的形成，而且PD病人死后尸体解剖也发现路易小体周围有铁环绕[8]，提示铁对SN多巴胺能神经元损伤可能与路易小体形成有关。路易小体的主要成分是alphasynuclein，文献报道，alphasynuclein在铁的存在下可以生成有毒性的不溶的聚集体[9]。所以，铁也可能通过导致路易小体形成而导致SN多巴胺能神经元死亡。
本室前期研究已显示，直接在大鼠SN内注射FeCl3可使损毁侧多巴胺释放量和含量均降低[10]。口服铁螯合剂可以抵抗铁导致的损伤作用[11]。同时，在MES23.5细胞系上也证实了铁对多巴胺能神经元的损伤作用[12]。提示铁可能参与了SN多巴胺能神经元的选择性损伤。因此，本实验在高铁饮食动物模型上，观察了SN和VTA的铁染色阳性细胞数。结果显示，给予高铁饮食后，SN内铁水平明显增高，而VTA内铁水平未见明显变化，提示铁在SN的选择性聚积和TH阳性细胞数减少间存在着相关性，SN和VTA内铁含量差异可能是导致SN和VTA多巴胺能神经元不同损伤的原因之一。
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