牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（

　　论文关键词：牙龈卟啉单胞菌　菌毛　大肠杆菌表达系统　融合蛋白　固定化金属螯合亲和层析

　　论文摘要：研究背景：慢性牙周炎在我国有很高的发病率，严重影响国民健康水平。慢性牙周炎不仅是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，而且还可能是某些系统性疾病的危险因素。慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, Pg）是其主要可疑致病菌。菌毛（fimbriae）是Pg的重要致病因子，可介导Pg附着于口腔内各种组织细胞的表面，以有利于Pg在体内进一步的粘附和侵袭；可引发炎症反应和免疫反应。并且菌毛具有良好的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答。目前，慢性牙周炎的治疗效果还不理想，因此探索预防慢性牙周炎的有效途径具有重要意义。

　　研究目的：本研究拟在大肠杆菌中表达FimA蛋白并进行蛋白纯化。为后续实验制备抗FimA蛋白的多克隆抗体提供实验基础。

　　研究方法：1. 以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS为宿主菌，用IPTG诱导fimA表达，通过SDS-PAGE和Western blot来验证蛋白的表达结果，并进行蛋白表达形式分析。2. 大量诱导表达融合蛋白，用Co2+柱亲和层析纯化表达产物，通过SDS-PAGE和Western blot来验证纯化产物，纯化产物经透析复性后用BCA法蛋白定量试剂盒作蛋白含量测定。

　　研究结果：1. 经IPTG诱导表达后，工程菌在SDS-PAGE上出现一条新蛋白带，分子量与预期大小基本一致（约41kDa），IPTG浓度及诱导时间对融合蛋白表达量影响较大：当IPTG浓度为2 mmol/L，诱导时间为3 h时蛋白表达量最大；当IPTG浓度为1 mmol/L，诱导时间为1 h时蛋白表达量最小。6×His-FimA表达产物经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜，X线片感光，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒pET-15b对应位置未见特异条带。蛋白表达形式分析结果表明表达的融合蛋白位于包涵体中。2. 表达产物经Co2+柱亲和层析， SDS-PAGE上出现一致的单一条带，其分子量大小与预期相符（约41kDa）。6×His-FimA纯化产物经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜，X线片感光，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，条带位置与BL21(DE3)pLysS全菌诱导表达后相应蛋白位置一致。经BCA法蛋白浓度定量试剂盒对纯化后的蛋白质进行定量分析，计算出纯化后的FimA蛋白浓度为0.96 mg/ml。

　　主要结论：用本课题组前期构建的fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，fimA基因能够得到正确表达。表达产物经Co2+柱亲和层析，可以得到带6×His标签的FimA融合蛋白。

　　1 绪论

　　慢性牙周炎是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，在我国有很高的发病率，严重影响国民健康水平。牙周炎造成的牙周组织的破坏是持续性的，一旦发生，目前的治疗手段还不能使牙周组织达到完全的恢复。牙周炎还可能是某些系统性疾病的危险因素。随着我国经济的发展、人民生活水平的提高和人群寿命的延长，对牙周健康状况的关注日益提高。因此，探索预防慢性牙周炎的有效途径对于提高国民健康水平具有重要意义。

　　疫苗在人和家畜疾病防治方面具有极大的作用，是一种有效的防治疾病的手段。从减毒活疫苗、死疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗到DNA疫苗，由于技术不断改进，使得疫苗有了广泛的应用，被成功的用于许多细菌或病毒感染的防治，因此以疫苗来防治牙周炎也已成为一个重要思路。

　　慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg)是其主要可疑致病菌[1]。菌毛是Pg表面主要毒力因子之一，菌毛蛋白(fimbrillin，FimA)是其主要亚单位，能够介导Pg对宿主组织的粘附与入侵，以及与口内其他细菌的粘附共聚[1-3]，还能刺激炎性因子的产生[4]。多菌毛Pg野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收，而无菌毛的突变菌株则不会造成牙槽骨的破坏。也有实验发现，用FimA免疫大鼠可减轻由Pg引起的牙槽骨破坏[5]，将抗FimA的单克隆抗体用于口腔被动免疫，可以抑制该菌在口腔的定植[6]。因此，可以将FimA作为防治牙周炎疫苗抗原。

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