牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（(9)

　　翻译起始区的二级结构也影响基因表达效率。Chen等通过改变Shine-Dalgarno序列上、下游的核苷酸，减少二级结构的形成，提高了基因表达水平。与此类似，也有一些基因通过共翻译，也就是在一段翻译序列的下游插入目的基因编码序列，提高了表达水平。

　　2）密码子的使用

　　遗传密码与氨基酸并不是一对一的关系，61种密码子编码20种氨基酸，而其中只有两种是由单一密码子编码的，其余的18种中的每一种都有多个密码子，编码同一种氨基酸的不同密码子的使用频率也是不同的。

　　如果编码区中有大量的或成串儿的稀有密码子，通过突变或基因重合成去除这些稀有密码子，可以提高表达水平。另外，如果靶序列中有稀有密码子AGA或AGG，会带来一些特殊问题，因为它们在编码区内部又形成额外的Shine-Dalgarno序列。

　　编码外源蛋白氨基酸的序列对表达水平也有很大影响。因此有必要用聚合酶链反应（PCR）或定点突变的方法，把表达基因N端的7～8个密码子变成大肠杆菌中最常用的密码子。还应尽可能通过这些方法将靶基因5'端（G+C）含量降至40％以下。

　　3）培养条件优化

　　在表达系统相同的情况下，不同的培养基常导致表达水平的巨大差异。LB类标准培养基可以用于建立表达的基本参数，但只有对培养条件进行优化后，才能获得最佳表达，包括使用基本盐培养基，如M9，限定盐培养基，如诱导培养基，或丰富培养基，如肉汤、YT或NZCYM。

　　一些培养基添加剂能提高某一种特定蛋白的表达水平。这其中包括浓度在0.1～0.5 mol/L之间的NaCl、不可代谢糖如蔗糖（0.2～0.6 mol/L）、辅助因子（血红素）和抗生素。Lee和Beckwith注意到，分泌途径缺陷的抑制基因位于与蛋白质合成有关的基因上，这些抑制突变的最终效果是降低蛋白合成速率，而低浓度抗生素能在大肠杆菌中模拟它的作用。表达外源蛋白尤其是分泌蛋白时，在培养基中加入抗生素，如氯霉素（1 μg/ml）和四环素（0.1 μg/ml），能降低蛋白合成速率，防止分泌系统过载，分泌蛋白也就更容易与伴侣分子等结合，折叠成天然构象。最后，培养基的pH也能影响外源蛋白的表达，当LB培养基的pH降至5.5以下时，可溶性的α-葡萄糖苷酶的表达量显著提高。极端pH可能会使细胞生长速率降低，从而防止细菌表达/加工系统过载。

　　在克隆基因的上游插入强的可调节启动子和有效的核糖体结合位点，可以在细菌中表达非融合蛋白。融合蛋白能大量制备，易于纯化，而且能赋予蛋白新的免疫学或生物学分析反应特性。 

　　2.5 六聚组氨酸融合蛋白的纯化
　　近年来，随着蛋白质组学研究的发展，基因工程重组蛋白的分离纯化技术显得尤为重要，要将目标蛋白从复杂样品中快速、特异地纯化出来，就需要选择合适的蛋白纯化方法。

　　融合标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术。融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便，并很快得到了应用。目前常用的蛋白纯化标签是GST（谷胱甘肽巯基转移酶），6×His（六聚组氨酸）和表位标签（如FLAG是专为蛋白纯化和检测设计的八肽，HA是流感病毒血凝素表位等），其中6×His最为常用，带有6×His标签的融合蛋白可利用固定化金属鳌合亲和层析和免疫亲和法进行纯化。

　　Porath于1975年首次提出固定化金属螯合亲和层析(IMAC)的概念[72]，该法基于蛋白质表面的组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等残基与固定化金属离子的相互作用而对蛋白质进行分离纯化。其中，组氨酸是与金属离子作用较强的氨基酸，含有多个组氨酸的蛋白质可在IMAC中有效保留，故人为设计的多聚组氨酸便成为最常用的蛋白质纯化标签[73]。

　　免疫亲和纯化是一种利用抗原抗体特异性可逆结合特性的技术，它具有高效、高收率、浓缩效应等优点。在众多蛋白质纯化技术中，免疫亲和纯化是十分关键的技术。标签融合蛋白可通过抗标签的单克隆抗体和多克隆抗体来纯化。多数免疫亲和纯化都使用单克隆抗体，但有两种类型的多克隆抗体可用于免疫亲和纯化，即针对合成肽(如6×His、FLAG标签等)或某种抗原的特定区域产生的抗体。在这两种情况下，由于结合到固定化抗体上的抗原位点局限在一个很小的区域，因此可实现有效的洗脱。目前已有商品化的特异性针对标签的单克隆抗体，但价格都比较昂贵。

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