牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（(2)

　　Pg菌毛的单体是FimA，由单拷贝fimA基因编码。fimA基因全长1290 bp，开放读框包括1044 bp，编码347个氨基酸。翻译后产物菌毛蛋白的功能域（如刺激T细胞和B细胞的位点、刺激细胞因子产生的位点等）位于氨基酸序列的31～331aa不等，各个位点之间可相互交叉或覆盖。近年来由于分子生物学和免疫学的发展，fimA基因已被克隆和测序，对蛋白质分子中的各个功能区、抗原表位已有了更深入的了解，为研制疫苗提供了可靠的依据。

　　根据国内外研究进展，在前期已构建fimA原核表达质粒的基础上，本研究拟在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中表达FimA融合蛋白，并通过金属螯合亲和层析技术进行纯化，为后续实验制备抗FimA蛋白的多克隆抗体、研发用于人类的、可有效防治牙周炎的DNA疫苗提供实验基础。

　　2 文献回顾
　　牙周炎是口腔疾病中的常见病和多发病，在我国有很高的发病率[7]。牙周炎累及牙齿数目多，预后差，是造成牙齿缺失的主要原因。随着我国进入老龄化社会，牙周炎的预防将成为突出的保健问题。世界卫生组织已将牙周组织健康列为健康人的十项标准之一[7]。探索预防和治疗这种严重危害人类口腔健康的疾病的方法，对于改善我国人民的口腔健康水平，提高人们的生活质量有着重要意义。

　　大量的实验研究、流行病学资料和临床观察表明[7]，牙周炎是菌斑微生物引起的感染性疾病。菌斑微生物是引发牙周炎的始动因子，是造成牙周组织破坏的必须因素。牙周菌斑中绝大多数细菌为口腔固有菌丛，对宿主无不良影响，仅少数细菌与牙周炎的发生、发展密切相关。其中牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, Pg）是目前获得公认的一种牙周致病菌，它是牙周病，尤其是成人慢性牙周炎病变区或活动部位最主要的优势病原菌，而健康龈沟内很少[7, 8]。目前牙龈卟啉单胞菌也是牙周微生物学领域重点研究的厌氧菌之一。除口腔疾病外，在全身系统性疾病的研究中，血清学、动物模型、细胞培养的研究证实[9-11] Pg感染与心脑血管疾病的发生有关，而且有学者报道[12]Pg的感染与低体重婴儿的分娩也有关。

　　Pg含有大量毒性因子，如蛋白酶、菌毛、脂多糖、血凝素等。其中菌毛在牙周致病作用中占据重要地位，而且与Pg在口腔的定植有关，为Pg的优势抗原之一。另外，因其具有广泛的生物学活性而成为牙龈卟啉单胞菌研究的一个热点。

　　菌毛（pili，fimbriae）是位于革兰氏阴性菌Pg菌体表面的一种弯曲的、单股的丝状物，长0.3～1.0 μm，直径为3.5～5.0 nm，遍布细菌表面，多者每菌可有数百根，由菌体表面伸向细胞外。其化学组分是一种蛋白质，与细菌的运动无关。

　　2.1 菌毛的致病机制 2.1.1 介导Pg附着于口腔
　　Pg附着于宿主组织表面是其定植于口腔的关键，也是其致病的先决条件。Pg可选择性的直接附着于口腔内特定部位组织的表面，或识别已经附着在组织表面的细菌，然后间接的附着于组织表面。

　　1）菌毛可介导Pg附着于口腔内各种组织细胞的表面

　　菌毛可介导Pg黏附于龈沟液中的成分（如人血红蛋白和纤维蛋白原）；唾液中的重要蛋白质成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG、富酪蛋白PRT）；乳铁转运蛋白，细胞外基质蛋白（ECM）（如玻连蛋白和纤维连接蛋白）。人细胞外基质蛋白通过与FimA受体配体的结合在细胞外信号转导中起重要作用。菌毛对基质蛋白有很强的亲和力，而且明显抑制玻连蛋白/纤维连接蛋白与其受体αβ3和配体α5β（在中国仓鼠卵巢CHO细胞株中过度表达）的相互结合。在牙周组织中，菌毛可能通过细胞外基质蛋白受体/配体途径阻断细胞外信号转导。

　　菌毛还可介导Pg黏附于牙龈上皮细胞、牙周袋上皮细胞、人口腔上皮细胞、人脐静脉内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞，附着并凝集人或羊的红细胞等。Umemoto[13]构建了无菌毛的Pg突变株，发现其对人口腔上皮癌细胞的黏附性和侵袭性均降低，接种小鼠后引起牙槽骨丧失的量也减少。其他学者构建了不表达菌毛的Pg缺陷株，发现它们黏附和侵袭人牙龈成纤维细胞[14]、上皮细胞[15]、内皮细胞[16]和树突状细胞[17]的能力也降低，甚至不能黏附。这些研究结果说明菌毛在Pg黏附于口腔上皮细胞的过程中起重要作用。

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