法医DNA分析技术

第十六章法医DNA分析技术

第一节概论

1985年英国遗传学家Alec Jeffreys建立了DNA指纹技术，并成功的应用于一起移民案涉及的亲子鉴定，开辟了法医物证DNA分析的新纪元，实现了法医物证鉴定从否定、排除到认定的飞跃。法医DNA技术在短短的十几年里得到了飞速的发展和广泛的应用。特别是在2000年全国公安系统开展打击拐卖妇女儿童专项斗争中，应用DNA分析技术进行了大量的亲子鉴定。辨明了被拐儿童的身份，使他们回到了亲生父母的身边和亲人团聚，从而使广大公安政法人员及人民群众认识到法医DNA分析技术的重要作用。

一，法医DNA分析研究的内容。

法医DNA分析是应用现代DNA分析技术，分析DNA遗传标记在群体中的分布与传递规律 。确定分析样品的一致性与遗传关系，为侦察破案和司法审判提供证据的一门科学技术。他涉及遗传学，分子遗传学，群体遗传学，生物化学，分子生物学和计算机学等多门学科的交叉和综合应用。

脱氧核糖核酸简称DNA(deoxyribonucpeic acid )是存在于细胞中的遗传物质。它包含了机体发育和功能所必需的全部信息。除同卵双生外，每个人的DNA碱基(A、 T、 C、 G)序列均不相同，是独一无二的。这些DNA序列上的差异有的在个人特征如眼睛、发色、肤色等表现出来，更多的是不表现在个人的生理外观特征上，必需用实验室特殊技术才能测定出来。法医DNA分析就是应用特殊的实验技术研究个体间的DNA差异及其遗传规律，而服务于侦察破案和司法审判。(

自1985年DNA指纹诞生以来，经过十几年的发展，法医DNA分析已建立了DNA指纹技术，PCR扩增片段长度多态性分析技术和线粒体DNA测序等三大主要技术，并在此基础上发展了一些新的技术方法如MVR——PCR、PCR——SSOP、SSP——PCR等共同形成了法医DNA分析技术。

二，法医DNA分析的对象

法医DNA分析的案件中主要涉及人体各种体液斑、组织、毛发及表皮脱落细胞等。但是在某些案件中已涉及到动物、植物及犯罪现场土壤中微生物的DNA分析。

三，法医DNA分析的任务。

法医DNA分析的主要任务是个人识别和亲子鉴定，由于DNA遗传标记的高识别率，Y染色体遗传标记呈父系遗传，线粒体DNA呈母系遗传，从而使亲子鉴定由过去一般遗传标记亲子鉴定的有限范围得到较大的扩大，可以进行隔代、几代甚至多代的亲子关系鉴定。

四，法医DNA分析的应用范围。

法医DNA分析应用于所有涉及有细胞的生物物证的案件中。(1)凶杀、性犯罪、恶性械斗。(2)犯罪现场无意中留下的指纹、毛发、唾液(烟头、口香糖、面罩盗窃案使用的面罩等)。(3)碎尸案尸源鉴定。(4)空难或突然性事件中尸源认定。交通事故中尸源及带有可疑血痕，组织，毛发等肇事车的认定。(5)拐卖儿童、离婚、移民、入户、寻亲、遗产继承、计划生育超生及医院错抱婴儿的亲子鉴定。(6)器官移植，医疗纠纷中的个人识别与亲子鉴定等。

五，法医DNA分析的特点。

DNA遗传标记与传统的蛋白遗传标记相比有以下特点。(1)遗传标记多，信息量大。(2)标记的遗传类型全，常染色体遗传标记按孟德尔规律遗传，Y染色体的遗传标记呈父系遗传，线粒体DNA呈母系遗传。(3)可分析的物证种类多，存在广泛。凡是含有细胞的生物物证均能进行DNA分析。(4)DNA在自然环境中具有较高的稳定性。保存几十年的血痕，精斑可进行DNA分析。(5)同一个体物证具有比对的通用性。DNA遗传标记具有个体组织的同一性，可以用同一个体的任何组织或体液均能得到该个体相同全部遗传信息。因此进行比对和鉴定，不必采用相同的组织。(6)方法灵敏，检材用量少。以PCR技术为基础的分析方法只需ng级DNA就可获得检验结果。(7)自动化程度高，速度快。(8)可以建立数据库，进行查档对比，检索破案。

六，法医DNA发展简史与进展 (一)法医DNA发展简史 1944年，Oswald Avery证实了细胞成分DNA(脱氧核糖核酶deoxyriibonucleic Acid)为遗传

特征从上代向下一代传递的载体。1953年，James Watson和Francis Crick阐明了DNA分子结构为双螺旋结构。1980年，David Bostein和同事首先发现在遗传水平上人群间存在小的差异，用RFLP技术检测这种差异。1984年，Alec Jeffreys在调查疾病的DNA遗传标记时，发现了DNA指纹图(DNA fingerprint)。1985年，首次进行一起移民涉及的亲子鉴定，1986年首次应用于二起强奸杀人案。1985年，Kary Mullis发明了多聚酶链反应(polymerase chain Reaction，简称为PCR)，同时4色荧光自动测序问世。1990年，PCR技术在法医学应用，第一个用PCR分析的遗传标记为HLADQα。1990年，Jeffreys报道小卫星D1S8基因座串联重复单位内部存在差异，1991年报道用；MVR—PCR分析小卫星可变重复序列。1991年，荧光标记复合扩增分析STR基因座和应用Chelex—100方法提取DNA。1992年，开始报道用毛细管电泳分析STR结果。1993年，第一个商业STR试剂盒面世，PCR同步扩增Amelogenin基因座进行性别鉴定。1996年，多色荧光标记STR试剂盒向世，开始报道用MALDI—TOF分析STR扩增产物和线粒体DNA基因芯片。1997年，开始大量报道Y—STR基因座。1998年，2 000个SNP杂交芯片闻世。1999年，Y—STR得到比较广泛的研究、应用。2001年，人类基因组计划框架初步完成。

(二)国内外进展

DNA指纹技术问世后受到了各国司法、警察和法庭科学界的高度重视，各国广泛研究和采用DNA技术进行办案。欧洲各国初期广泛采用的主要是DNA纹印系统，北美除DNA纹印系统外，开发和应用了HLADQa和Polymarker等系统，现在世界各国广泛使用的是复合STR系统，并进行DNA的直接测序分析(主要用于mtDNA)。

我国于1986年开始法医DNA分析技术应用研究，1988年有研究成果报道，1989年正式应用于实际案件鉴定。研究和应用的法医DNA分析主要有DNA指纹(3′HVR—α—珠蛋白探针，Myo探针等)、小卫星(VNTR)扩增片段长度多态性(D1S80，APOB等)、微卫星(STR—PCR)复合扩增、数字编码小卫星系统、线粒体DNA测序、DNA的性别鉴定。等等。现在广泛使用的是复合STR系统和DNA的直接测序分析(主要用于mtDNA)。

20世纪末的微制造技术解放了集成电路工业，加快了计算机的速度和运行能力。同样微制造技术使DNA分析中的样品制备和一些分析步骤微型化，设计一些仪器可以在犯罪现场进行生物物证的分析，使DNA分析比传统实验室分析得更快、成本更低。目前在研究开发的主要有以下三个微型化DNA分析仪器：微芯片毛细管电泳装置(microchip capillary electrophoresis device)、微型热循环仪(miniature thermal cycler)和杂交阵列(hybridization array)。未来的法医DNA分析发展方向是微型化、智能化、网络化与全自动化，从DNA分析的结果中获得更多的个体信息。

第二节检材的提取、保存与送检

DNA分析检材的提取、保存与送检原则与一般物证检验相同下面介绍常见检材的的提取、保存与送检方法。

一、 常见检材的提取与保存 (一)血液和血斑

1．新鲜血液 (1)新鲜血液由医务人员用无菌一次性的注射抽取1-5ml静脉血液，加入EDTA二钠盐或枸缘酸钠抗凝放入试管中，充分混匀，加封。或者将抽取的血液直接涂抹在无菌纱布或干净滤纸上，晾干制成血痕，也可采集末梢血制成1 cm 2以上的血痕。如果要进行DNA指纹分析，以液体血液送检为最佳。(2)每个试管应标明日期、时间、嫌疑人的姓名、地点、采血员的姓名、采集的数量、案件名称编号和物证编号。(3)血液样品应置于4℃冰箱保存，制成血斑的，则在室温晾干，并应尽快送检。

2．现场的液体血 (1)液体血应该使用干净的(最好是灭菌的)注射器或一次性吸管，将其吸至洁的(最好是灭菌的)试管内。(2)凝血块可以使用清洁的药匙将其移至清洁的试管内。(3)可以使用清洁的纱布吸取液体血或凝血块制成血痕，在包装和送往实验室前应晾干(禁止阳光直射)。(4)标明样品案件名称编号、物证编号、日期、时间、采集物证的位置，以及物证采集员的姓名。

3．冰雪上和水中的液体血 (1) 冰雪上和水中发现的血液应立即提取，以免被进一步稀释。(2)将那些最浓的样品尽可能地搜集到清洁、适合的容器内；采集时应尽可能避免杂质污染。

4．衣服上的未干血斑 (1)将带有未干血斑的衣服放在一个清洁的表面晾干(避免阳光直射)，不能用电吹风等热力加速干燥(2) 晾干后用干净的纸包装起来或装入纸袋内。(3)禁止抖动带血斑的衣服，以防引起血痂的脱落。

5．物品上的未干血斑 (1)带有未干血斑的小件物品应晾干后整件收集并包装。(2)对于不宜从现场移出的大件物品存在的未干血斑，将其转移到干净的棉纱布上晾干后装入纸袋内。

6．大的或不可移动物品上的干血斑，如墙壁或混凝土上的干血斑 (1)对血斑的形状必须做记录、照相并且画图。(2) 用蒸馏水湿润清洁的纱布或拭子将血斑样品擦拭转移下来或将血斑直接刮到一张清洁的纸上；或用高粘质胶带将每一个斑点从其所在的物体表面上粘下来；或用一个小吸管吸少量蒸馏水置于斑痕上，反复吸排多次，将斑点从物体上洗下来，然后将样品吸到一个清洁的试管内。(3)转移到纱布或拭子的血要晾干，再将其放在专门的纸袋。(4)每一件物证都要收集没有斑痕的部分，作为“基质对照”送验

7．可以切割的物体，如地毯或室内装潢材料上的干血斑 (1)详细记录、照相斑点情况。(2)用一个清洁的刃器将带有血斑部分的物证材料切割下来。(3)对每个切割下来的物证都应该分别包装和标记。

8．小的飞溅的血点常常很难从物体的表面上转移下来。在做了适当的记录以后，可以用胶带或湿润的消毒棉纱线将样品提取下来，应避免从周围区域提取污染物。

9．交通肇事案件中汽车上的血斑 (1)全面检查汽车的外表面，确定有无毛发、组织、血液、以及其他的痕迹物证。所有的检查发现都要一一记录。发现血斑用湿纱布转移提取血斑，然后晾干包装。(2)如需要进行指纹显现，宜用对DNA检验无害的显现方法，如铝粉法显现指纹。否则应在显现指纹前提取血斑。

10．尸体上的血斑 (1)尸体上的血斑在提取前应仔细记录。(2)应注意血斑的位置；大小、数量、形状和类型。(3)由于尸体上血斑易于脱落，因此在移走尸体以前将血斑提取下来。(4)在收集尸体上的血斑时，为了减少附带尸体本身的皮肤细胞，应尽可能轻轻地将斑点取下。如使用湿纱布轻轻地擦拭斑痕。(5)指甲下的血斑应该使用清洁的牙签刮下。用清洁的指甲剪将指甲剪下并收集起来。尽量不要带死者本人的血液和组织。每个指甲和牙签均应分开包装。

（二）精液和精斑

1．现场上发现的液体精液物证 (1)精液物证应该照相、录像和画图记录。(2)用一个清洁的注射器或一次性吸管将液体精液吸至一个灭菌的试管内保存在冰箱内。(3)也可将液体精液吸取到干净的纱布或棉球上。然后晾干、包装、加封和标记。

2．可移动物体上精斑 (1)裤子、衣服、床单、枕头、纸张，以及其他可移动物体上的精斑整件进行收集。(2)如果物品上的斑痕是湿的，在收集包装以前必须将其彻底晾干。(3)每一件物证都必须单独包装，并做好标记。

3．可以切割的大的物体上的精斑 (1)大的物体，如地毯、床垫、室内装潢材料上的可疑精斑可以将其切割下来。(2)分别包装并做好记录。

4．不可移动的、非吸湿性物体表面上的精斑(1)不可移动的具有非吸湿性表面的物体，如地板、柜台、金属表面的样品等。(2)提取精斑前必须做好采证记录。(3)用干净的解剖刀将精斑刮到干净纸上，然后将其折叠包起来。也可以用胶带粘下来或用棉球拭子将斑痕擦拭下来晾干。(4)分别包装并标记。

5．从性犯罪案件受害者身上提取精液 (1)性犯罪案件受害者的物证的采集应在医院、门诊室进行。(2)根据被强暴案情，用无菌纱布或棉球擦拭阴道、口腔(口交案例)和肛门(鸡奸)。纱布或棉球的面积千万不要过大，否则因擦拭物面积过大，精液斑不集中，影响下一步检验。提取的擦拭物要晾干保存。

(三)组织、器官和骨骼

1．新鲜组织、器官和骨骼 (1)每件物证都要采用各种方法进行描述，包括笔录、照相或录像做采证记录。(2)每个物证都要使用一个清洁的器械进行收集。所使用的镊子在使用之中，要彻底地进行清洗。对腐败尸体，要取深层肌肉或肋软骨。放在一个清洁的可固定的容器内。(3)密封后，做好标记并放冰箱冷冻保存。

2．陈旧组织、器官和骨骼 (1)在收集前应该对每个物证进行拍照和画图。详细记录大小、

形状、类型及其和其它物证相互之间的空间关系。(2)每个物证都应使用清洁的镊子提取。对仍然连在一起的物证应该一块儿提取。收集时不应将其分开。(3)骨骼尽量提取长骨，而且不要人为地将长骨切成两截。否则，骨内DNA容易被污染。

(四)唾液、尿液和其他体液

1．液体样品 (1)液体的唾液或尿应尽快装入一个清洁的消毒的容器内(试管或烧杯)。(2)每个容器上都要加封并做好标记冷藏保存。

2．斑迹 (1)唾液斑、尿斑和其他体液斑可以整件物证收集，也可以将其从载体上刮下或剪切下，予以收集。(2)物证必须彻底干燥并且放入纸袋内。刮削物和剪切物应收集在一张清洁的纸上并折叠包好。然后再将其放人第二个纸包装袋内，加封并做好标记。

(五)毛发

(1)用清洁的镊子夹取毛发。(2)不在一起的毛发应分别搜集、包装，做好标记。(3)在收集过程中必须小心操作，不要损坏可能存有的毛根组织。(4)与血液、组织、或其他体液混合存在的毛发，提取时应小心处理。每个物证都要单独包装，并做好标记。(5)如果毛发与体液混在一起，应晾干后包装送检。

(六)强奸致孕案件的检材

受害人被强奸致孕，如果已人工引产，可用干净无菌的手术刀切开胎儿颅骨，用干净无菌的药勺或滴管取引产胎儿脑组织，放人干净试管或烧杯内，或取胎儿肌肉，登记受害人姓名、采集时间、地点和采集人等，密封，冷冻保存，送检。如未人工流产(怀孕3个以内)可在医院采集绒毛。如要人工流产，一定在流产前告知医院妇科彻底清洗吸引器，不能留有其他人的组织，而且吸引时不能将胚胎弄得太碎，以免分不清是胚胎还是母体组织。

二、检材的送检

提取的检材要尽快送往实验室进行检验。在送检现场提取检材的同时，采集与案件有关人员的样品并一同送检。有关人员的样品一般均采集其血液，或制成血痕，血液采集方法同前。在送往实验室的过程中也要注意避免检材DNA发生降解，为此在送检过程中要尽量避免检材经受高温、高湿、日光照射以及过长的运输时间，鲜血要求放在冰壶中送检。不同案件需要收集的有关人员样本如下。

1．现场物证为精斑的案件：要求采集受害人、有关犯罪嫌疑人的血液(痕)；如果精斑的载体上有可能留有其他人的精斑如受害人丈夫等，必须采集他们的血液(痕)一同送检。

2．强奸致孕的亲子鉴定案件：采集受害人血液、受害人所怀胎儿组织或绒毛(未人工流产)与有关嫌疑人血液。

3．确定身源的亲子鉴定案件：除现场检材外，还需采集嫌疑父母血液、或妻儿(或丈夫和孩子)，如因某种原因不能采集到其嫌疑父母血液、或妻儿(或丈夫和孩子)样品，可采集嫌疑人的同胞血液，并尽可能多地采集所有同胞血液，或同一父系的或同一母系的亲属血液送检。

4．个体识别类的案件：现场检材以及比对样品，如嫌疑人、受害人血等。

第三节检材的DNA提取

DNA存在于细胞内，在进行DNA检验前，需将DNA从细胞中提取出来将其与细胞其他成份分开。现场提取的检材如血痕、精斑等常留于各种载体上也需将其分开。目前DNA提取常用方法有(1)有机提取法(经典的饱和酚-氯仿法) (2)Chelex-100提取法(3)无机提取法(4)其他提取方法如磁性珠提取法、硅珠提取法、碱裂解法等。

一、 常见检材的DNA提取

(一)有机提取法提取各类检材DNA

1．血液 (1)3ml EDTA—抗凝血，加入等体积裂解液，剧烈振荡，使细胞裂解，溶液呈透亮状。(2)3 000-5 000r／min离心15min，去掉上清液，收集沉淀，用3ml生理盐水洗净沉淀，3 000-5 000r／min下离心15min，收集沉淀，如果此时沉淀仍带有红色，再反复用生理盐水洗沉淀，直至沉淀呈无色。(3)加入1.5mlEDTA—Na2提取液，悬浮沉淀，并反复吹打，使沉淀分散开来。(4)加入1／10体积10％SDS，使其最终浓度为1％混匀。(5)加入1／20体积2mg／ml PK (最终浓度100μg／ml)，混匀，封口，置于37℃保温4h。(6)向溶液加入等体积的饱和酚，以上下反复颠倒试管混匀液体，将试管内溶液混合成乳状液。3 000～5 000r／min下离心

5min，此时溶液分成三层，DNA在无色的上层水相中，中间白色混浊层为变性蛋白质。最下层带褐或黄色的是酚。(7)转移上层水相到一干净试管中。为增加DNA回收量，可以在有机相中加入等体积TE溶液(pH7．8)，充分混匀后，离心，吸取上层水相，与第一次抽提的水相合并。(8)加入1／2体积的饱和酚和1／2体积的氯仿—异戊醇（24：1），混匀。3000—5000r／min离心5min。如果水相层和有机层的界面不甚清楚，说明其中含蛋白质较高，可采用多次酚／氯仿抽提，并可适当加大离心速度和或延长离心时间。(9)转移上层水相到另一干净试管中，加入等体积的氯仿—异戊醇混匀，3 000-5 000r／min离心5min。(10)转移上层水相到另一干净管中，加入1／10体积的3mol／LNaCl轻轻混匀，加入2．5倍溶液体积的冰冷(-20℃保存的)无水乙醇，混匀，沉淀DNA。(11)10000r／min离心5min，收集沉淀，用70％乙醇洗去DNA中的盐，5 000r／min离心5min，除去液体，真空抽干DNA 5min，使DNA成无色透明状。(12)加适量(50—100u1)TE缓冲液溶解DNA，溶解后的DNA溶液于4℃保存。

2．血斑 (1)将血斑剪碎，加入适量TNE浸泡底物，TNE的体积以底物全部浸湿，底物表面还保留1-2mm左右高度的TNE溶液层为宜，加入1／10体积的10％SDS和1／20体积的PK(2mg／m1)使终浓度分别为1％和100ug／ml，37℃保温3小时。(2)用套管法离心(5 000r／min离心5min)除去载体底物。也可以不用除去载体，直接加酚抽提。(3)收集溶液，用酚—氯仿抽提，以下步骤同血液(6) — (12)。

3．精液与精斑 (1)取0．5ml精液加入等体积生理盐水，洗涤2-3次，3 000r／min离心5min，收集沉淀物，加入精子DNA提取液和蛋白酶K(终浓度为100ug／m1)混匀，于37℃水浴保温消化3h。 DNA提取及溶解过程同血液(6) — (12)。(2)从精斑中提取DNA ：方法基本同血斑将消化血斑用TNE改为精子提取液。

4．从精液和阴道分泌液混合斑中提取精子DNA（差异消化法） (1)精子检查：取少许检材经染色，于显微镜下观察，确认精子的存在。(2)将带有精子的检材剪碎，装入1．5ml离心管中，加lml TNE于37℃浸泡30rain。然后加入1／10体积的10％SDS至终浓度为1％，加蛋白酶K至终浓度40μg／ml，于37℃保温2h消化上皮细胞。对于那些需要对女性阴道上皮细胞进行鉴定的检材，加TNE后先在37~C保温1-2h，通过离心收集细胞，使女性上皮细胞和精子等细胞先与载体分离开来，此时不要加SDS和PK。然后在收集的细胞中加SDS和PK进行分步提取。(3)将消化后的混合物用套管法离心去载体，3 000-5 000r／min离心15rain，收集流出液中的沉淀物。(4)用TNE洗沉淀物，3 000—5000r／min离心15min，重复此步骤一次，收集沉淀物。(5)向沉淀物中加入精子提取液和蛋白酶K，终体积为300μl，PK终浓度为100ug／m1，于37℃水浴中消化3h。(6)DNA抽提步骤同血液DNA提取(6)—(12)。

5．人体有核细胞组织 取组织约0.1g，用生理盐水洗净附着的血液后将检材剪碎，加入DNA提取缓冲液，用匀浆器研磨，再加入蛋白酶K(终浓度200μg／m1)和1／10体积的10％SDS，于37℃消化3h。随后DNA提取步骤同血液(6)—(12)。 6．唾液(斑) 同血液(斑)。

(二) Chelex—100法提取微量检材DNA

1．血液 (1)取lO—50μlEDTA抗凝血加到0．5ml离心管中，再加入500μl灭菌蒸馏水,剧烈振荡，室温下放置15min。(2)13 000r／min下离心3min去上清液，收集沉淀，反复用无菌蒸馏水洗净白细胞沉淀物，直至无色或血色素很少。 (3)加入200μl 5％Chelex-100溶液，置56℃保温30—60min，振荡8s，100℃保温8min后，剧烈振荡8s，10000r／min下离心3min，上清液可用于PCR反应或者4℃保存。

2．血斑 (1)取0.2—0.5cm2的血痕放入0.5ml离心管中，加入500ul无菌蒸馏水，剧烈振荡，室温下放置15min。(2)13 000r／min下离心3min，去上清液，收集沉淀，载体不需要去除，始终留在离心管内。(3)同血液(3)。 3．精液和阴道分泌液混合斑 按有机提取法中精液和阴道分泌液混合斑提取DNA方法解分离理除去混合斑中上皮细胞，干净的精子沉淀物用200μl 5％Chelex-100溶液悬浮，加DTT和PK至终浓度分别为39mmol／L和100μg／ml，在旋涡振荡器上振荡7秒钟，56℃保温过夜，振荡7秒钟，100℃保温8min后，剧烈振荡7秒钟，10000r／min下离心3min，上清液用于PCR反应或4℃保存。

百度搜索“70edu”或“70教育网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，70教育网，提供经典综合文库法医DNA分析技术在线全文阅读。