可口可乐无菌验证(2)

8. 接种室的准备：一房间作为接种室，内部有恒温设施，温度计，湿度计，生石灰（作为干燥剂），桌，椅各一张。出入此房间人员必须严格控制或者指定专人房间保管钥匙 第三部分：S3验证步骤

1. 生产部保证灌装机可以正常运行

2. 生产部要在注入间内放置两张用于放置瓶子和剪瓶子的非木质桌子。 3. 微生物工程师准工作（由克朗斯微生物工程师主导）：

104接种：将稀释至106/105 菌悬液，用移液枪取0.01ml/0.1ml至验证所用PET空瓶外表规定区域，在该区域作好标记，室温干燥4-8小时不等，具体数量和部位参照Validation Protocol（可以事先备好生石灰做干燥剂）。准备好30个1.25L产品的纸箱，顶端开瓶口大小圆孔，安置倒置干燥之PET瓶，空瓶按照实际情况放置（比如接种点为瓶底，瓶子要倒置插在纸箱上安放，干燥）。 4. 接种瓶上菌液干燥后，就可进行S3。

5. 接种后PET瓶，使用塑料袋，按照不同部位，将175个已接种的PET瓶分成5个组别，从接种室转移到注入间，以35个一组（5个备用），挂上风道。 6. 按照规定最大灌装速度（比如NT480瓶型对应的36000bph），进行验证。 7. 杀菌后PET瓶不封盖，迅速从注入机出口运输带取出，放入已杀菌的速封袋，转移至指定区域，把PET瓶做标记部分剪下，放入洗脱液中（放置洗脱液与接种样品的小盒子，必须事先用标签纸标示清楚，待用）。

8. 将样品的洗脱液充分摇匀晃（接种在瓶口罗纹部分的样品需要摇晃25分钟，其余区段产品摇晃20分钟），摇匀后将样品置于超净工作台上取出，直接对洗脱液进行膜过滤，取下滤膜，放入事先准备好的TSA培养基平板（事先倾倒好无菌培养基）。将平皿放入35-38℃培养箱，48小时后计数。

9. 每个阳性对照做10-3稀释，10-4稀释，0.1*10-3稀释各一次。阳性对照建议一共5个点，每个点5组。 注意：

a. 剪下带有标记的瓶子时，每完成一个瓶子的剪切，必须使用1500ppm的PAA对双手，剪刀进行消毒。

b. 由于剪切样品数量较多，建议两组人员进行操作，每组两人，一人剪瓶，一人为另一人消毒）

c. 过滤时，使用100ml无菌水加入滤杯助滤.

d. 以上项目由克朗斯培训，微生物品控操作，同时由克朗斯微生物工程师主导。 第四部分：过程监控取样

由Krones提供取样培训、微生物品控取样，生产部协助通知取样时间、品控组长协助取样。从S3开始至结束，工厂品控人员需依据取样频率，进行微生物取样（无菌水总出水口、无菌空气、Hygiene Center无菌空气、Hygiene Center无菌水、冲瓶无菌水、冲瓶无菌空气），取样后进行膜过滤，以总菌以及霉菌/酵母温度培养。

现场的检测和巡检项目和正常时一致。

第五部分：用差值法计算每个瓶子，瓶盖所减少微生物的数量级：

R = log (C0) – log (Ct), 即:

R=数量级缩减量或者数量级毁灭量， C0 =初试微生物数量和 Ct =灭菌后微生物存活数量

外部表面杀菌测试可接受运行结果参考标准： 瓶子，瓶盖外部杀菌 通过 未通过 所有瓶子，瓶盖的每个接种点的生物负载量，至少减少3log ≥ 1 瓶子，瓶盖的接种点的生物负载量减少量小于3 log 无菌线S4验证SOP

目的：验证系统对包装材料内部表面消毒灭菌效果。

应用：瓶，盖必须与即将投入生产线生产的瓶，盖设计形状，尺寸相一致 第一部分：准备工作：

1. 仪器与试剂：移液枪（1ml，0.1ml，0.01ml，推荐另配一把1-9ml）以及枪头，细菌悬浊液（枯草芽孢杆菌ATCC 9372）， 100ml塑料圆盒150个，不锈钢托盘，锡箔纸，平皿（塑料/玻璃均可），OSA培养基，PCA培养基，吐温试剂（0.1% Tween(界面活性剂) / 0.1% peptone(蛋白胨)溶液），3M胶带，扎带，针筒（1ml，10ml各一个），振荡器，超声波洗瓶器，摇床，Duran瓶或者三角瓶制备培养基以及无菌水，以及其他微生物实验室仪器耗材等。 2. 接种：

10６接种：将稀释至10８菌悬液，用移液枪取0.1ml至刚吹好的PET空瓶内/空

盖内，拍打空瓶/晃动空盖，使菌悬液呈小水珠附着于瓶内壁/分布于空盖底部。

10５接种：将稀释至10７菌悬液，用移液枪取0.1ml至刚吹好的PET空瓶内/空

盖内，拍打空瓶/晃动空盖，使菌悬液呈小水珠附着于瓶内壁/分布于空盖底部。

具体数量参照Validation Protocol，空瓶室温干燥12-24小时/空盖室温干燥2-4小时（可以事先备好生石灰做干燥剂）。 第二部分：操作要求

1、 根据供应商所提供说明书用清洗灭菌条件的下限对无菌线设备进行一次CIP, SIP/ COP, SOP，生产线运行平稳时开始进行S4试验。

2、 接种PET瓶安置：菌液干燥后，就可进行S4。接种后PET瓶，使用塑料袋，将120个已接种的PET瓶，从接种室转移到注入间，挂上风道。按照规定最大灌装速度（比如NT480瓶型对应的36000bph），进行验证。杀菌后PET瓶

中注入100ml无菌水后用无菌洁盖/铝箔封盖，从注入机出口运输带取出，转移至指定区域，开盖后加入对应量的无菌吐温试剂，细沙等,剧烈晃动20分钟（强烈建议使用超声波水浴，对样品进行洗脱）。

3、 空盖安置：使用托盘铝箔纸，将接种好空盖覆盖好，转移至注入间。从下盖槽整齐排列。建议接种盖与洗盖槽中其他盖，以颜色区别。按照规定最大灌装速度进行验证。杀菌后瓶盖，从盖取样口，用已杀菌之容器盛接（例如烧杯/平皿容器等），然后放入对应量的已加入无菌吐温试剂，细沙的小盒子中,剧烈晃动20分钟（强烈建议使用超声波水浴，对样品进行洗脱）。

4、 记录下每个样本运行中的中断与停顿，同时也要记录下瓶，盖／铝箔的杀菌条件，冲洗条件以及其他关键的无菌系统测试运转的参数。

5、 作为一个阳性对照，在当天使用的样品干燥后（干燥和当天使用后），检验在各个浓度的已接种的瓶子，瓶盖各5个，检验它们上面的生物负载量

6、 作为一个阴性对照，取未接种的瓶子，瓶盖各3个，每个瓶子灌入±100 ml无菌吐温试剂，然后用无菌的铝箔或者瓶盖封口，然后将这些瓶子然后充分摇动瓶子25次，进行膜过滤对瓶中全部内容物(±100 ml)进行检验，来检验三个瓶子，盖子的总菌数。 第四部分：S4验证过程中无菌流体的取样

从S4开始至结束，工厂品控人员需依据取样频率，进行微生物取样-无菌水总出水口，无菌空气，Hygiene Center无菌空气，无菌水，以及冲瓶/冲盖无菌水，无菌空气的取样，要求现场微生物QC取样，取样后进行膜过滤，以总菌以及霉菌/酵母温度培养。

第五部分：用差值法计算每个瓶子，瓶盖所减少微生物的数量级：

R = log (C0) – log (Ct), 即：

R=数量级缩减量或者数量级毁灭量， C0 =初试微生物数量和 Ct =灭菌后微生物存活数量

内部表面杀菌测试可接受运行结果参考标准： 通过 菌体数量 未通≥ 1个瓶子，瓶盖含有 log微生物 ≥ 1 个瓶子，瓶盖上的 已接种5 log细菌量的瓶子，瓶盖 已接种6 log细菌量的瓶子，瓶盖 所有瓶子，瓶盖上含有 <1个单位杀灭每个瓶子，瓶盖上每个至少５过 ≥ 1单位菌体数量 被杀灭微生物量小于５log 无菌线S5验证SOP 目的：评价注入环境和设备外表面的无菌程度

应用：这一测试在完成CIP/SIP/COP/SOP后和LG培养基测试之前进行的，同时

这一测试将在LG培养基充填后再进行一次。 第一部分：准备工作

已倒入TSA无菌平皿（塑料/玻璃均可）7个（2个备用），无菌涂抹棒

40支，Duran瓶，或者三角瓶以制备培养基以及无菌水，以及其他微生物实验室仪器耗材等。温度测试贴条 第二部分：实验前处理及实验过程

1. 试验前确认：水处理、动力中心、灌装机、无菌水、化学中心处于正常状态。 2. 灌装机、无菌水进行CIP、SIP，参数确认，用温度测试贴条对微生物实验室

中的杀菌锅，SOP管路温度确认。 3. 通过烟来确认无菌区域空气的流向。

4. 灌装机进行碱性COP、酸性COP，SOP，参数确认 5. 检测无菌区和洁净室的空气质量，在1立方米的空气里取3-5个样品。取样器

可以选用Merck MAS ESO或者Millipore公司生产M air T的压缩空气取样器。选用TSA培养基培养。 6. 对灌装机进行尘埃粒子计数。 7. 灌装机进行SOP。

8. 做S5实验，根据公司标准进行涂抹取样分析。取样位置需包括：灌装阀，所

有除菌后的喷嘴处，及其它可疑处。其中的一半用于分析总菌，另一半用于分析霉菌和酵母菌。记录取样点及各取样点选取的原因。 9. 灌装机进行碱性COP、SOP 第三部分：空气取样点和涂抹点 空气取样点

position of air-borne CODE 代码 1 Name(Chinese) Name(English) Quantity 名称（中文） 名称（英文） 封盖区 Capper 数量 1 Result TC M&Y

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