激光扫描共聚焦显微镜技术

激光扫描共聚焦显微镜技术

Laser Scanning Confocal Microscope

——基础篇 李治国

细胞的内在生活 显微镜的发展史

没有显微镜就不可能有细胞学诞生。

1590年，荷兰眼镜制造商J和Z.Janssen父子制作了第一台复式显微镜。

1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓)，命名为cella。

1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。

Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723). Magnification ranges at 50-275x. 显微镜的最重要参数 ——分辨力

显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关。

分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 各种显微镜的分辨能力

光学显微镜（light microscopy）0.2μm

电子显微镜 (Electro microscopy) 0.2nm

扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ) 0.2nm以下 1932年，德国人M.Knoll和E.A.F.Ruska发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm的商品电镜。 1981年，瑞士人G.Binnig和H.RoherI在IBM苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。

常用的光学显微镜（light microscopy) ?普通光学显微镜 ?暗视野显微镜 ?相差显微镜

?偏光显微镜

?微分干涉显微镜 ?荧光显微镜

?激光共焦扫描显微镜 普通光学显微镜原理 普通光学显微镜原理图 1. 构成：

①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置

2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。 暗视野显微镜

根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜

观察到明场看不到的极其微小的物体 最高分辨率可达0.004微米 1 原理

丁达尔现象：在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这就是微粒的散射光。

暗视野显微镜就是利用微粒的散射光原理设计的。 2 结构特点

使用中央遮光板或暗视野聚光器（常用的是抛物面聚光器），使光源的中央光束被阻挡。不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。 暗场显微镜原理 3成像特点

在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像，并非物体本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。

一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力

为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。

4 应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。 5 暗场显微镜的要求

要求载玻片和盖玻片必须无疵痕和灰尘 物镜前透镜必须清洁无尘

载玻片和盖玻片厚度必须绝对符合要求 6暗场观察方式调节

(1)换上暗场聚光镜（干燥系或油浸系）并在聚光镜透镜上表面滴上镜头油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片底面相接触后。 (2)将视场光阑适当缩小，用10X物镜找到被检物体，同时在视场中看到视场光圈的轮廓象。上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈像清晰可见。

(3)视场光圈如不在视野中央，可利用聚光镜外侧两个调节螺丝进行调整，再将其开大到相应位置。

人的眼睛能够识别明与暗之差（光的强度）和颜色不同（光的波长不同），但难以识别差别小的无色的透明物体。

光对无色透明物体（相位物体）并不引起明、暗和颜色的变化，而只产生所谓的相位差。可是这种相位差不能用肉眼识别，也就看不见这种相位物体了。

相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。 相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅差(明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。 环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑。

用于观察组织培养中活细胞形态结构。活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨细胞轮廓及其结构，组织培养研究常用的是倒置相差显微镜。

偏光显微镜

依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜分辨率可达0.04微米将普通光改变为偏振光进行镜检,以鉴别某一物质具有单折射性(各向同性)或双折射性(各向异性)偏振光与自然光 1. 横波的偏振性

光矢量的振动方向总与光的传播方向垂直，在垂直于光传播方向的平面内, 可有不同的振动方向。

2.线偏振光--光矢量只在某一固定的方向上振动。 二、起偏和检偏

起偏：使自然光（或非线偏振光）变成线偏振光的过程。 检偏：检查入射光的偏振性的过程。

双折射现象：一束光射入各向异性晶体后有两束折射光的现象。尼科耳棱镜。

在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性，因此被用于组织细胞的化学研究。 寻常光线(o光):遵守折射定律。对于晶体一切方向都具有相同的折射率，且在入射面内传播。

非常光线(e光):不遵守折射定律。它的折射率随方向而变化，并且不一定在入射面内传播 。

o光和e光都是线偏振光,且振动方向相互垂直

二向色性：某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）对光振动有强烈的选择性吸收能力，这种性质称为二向色性。如电气石晶体对自然光的某一振动方向上的光振动几乎完全吸收，而垂直于该方向的光振动只稍微减弱后通过。

旋光现象：线偏振光通过某些透明介质后，它的光振动方向将绕着光的传播方向旋转某一角度? 的现象，称为旋光现象。这种介质称为旋光物质。如石英、糖、酒石酸钾钠等。 微分干涉显微镜

无色透明活体标本的细微结构 图象呈浮雕状的立体感 观察效果更加逼真 1 原理

通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，

光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。 2 特点

可以使被检物体产生三维立体感觉 观察效果更直观

无须特殊物镜，与荧光观察配合更好

可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。 荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点：光源为短波光，信噪比高 荧光显微镜 一、原理

荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。 荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点：光源为短波光，信噪比高

荧光光源 一般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。 每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。 荧光显微镜用途

1 观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构 2 标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜

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