激光扫描共聚焦显微镜技术(5)

色荧光的J聚体(J-aggregates)，最大激发和发射光谱波长约为590 nm 。

JC-1测定线粒体膜电位 五、细胞内活性氧

活性氧(active oxygen species)可影响细胞代谢，与蛋白质、核酸、脂类等发生反应，有些反应是有害的，因此测量活性氧在毒理学研究中有一定的意义。

根据检测活性氧的不同可选择不同的荧光探针。常用荧光探针有 (2，7-二氯二氢荧光黄乙酰乙酸、H2DCFDA)，其原理是不发荧光的H2DCFDA进入细胞后能被存在的过氧化物、氢过氧化物等氧化分解为二绿荧光黄 (DCF)而产生荧光，其反应灵敏到10-12 mol水平，荧光强度与活性氧的浓度呈线性关系。 H2DCFDA应用示例 （六）细胞间通讯 一、荧光漂白恢复

(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching） 定义:经荧光探针标记的细胞的某一区域一旦被高强度的 激光照射后,荧光物质的光化学结构被迫坏,荧光强度 下降, 且为不可逆的过程, 但此处荧光强度会渐渐恢 复,荧光强度恢复的快慢和多少,代表周围分子扩散 的速率,或分子运动速度。 R=(I2-I1 /I0-I2)′100%

R-荧光漂白恢复率：代表分子的运动速度

应用：细胞间通讯，细胞膜流动性，蛋白分子的运动 （七）光活化技术

定义：笼锁化合物全称为光致不稳定笼锁化合物，为人工合成的用隐蔽基团修饰生物活性分子的化合物，一旦被光照射，两者间的共价键解离而释放出活性分子，这一光活化技术称为解笼锁。 笼锁化合物的种类：笼锁的神经递质、笼锁钙等 共聚焦可控制使笼锁探针分解，从而有效地控制多种生物活性产物及其它化合物发挥作用的时间和空间 光活化技术

通过光活性物质控制神经活动只需要特定光束扫描预选的

活化位点，实验操作非常简单．结合荧光标记及成像技术，可以同时

记录所调控神经细胞的形态、位置信息以及功能信号，易于同时确定该细胞在神经网络中的结构定位和功能，因此具有广阔的应用前景．斯坦福大学的Zhang 和Wang 等2007 年发表在《自然》(Nature)上关于光控制神经回路的文章，被该杂志评为该年度最受欢迎的论文之一，并被麻省理工学院技术综述评为该年度十大最有影响的技术之一．

（九）细胞、亚细胞结构 标记细胞器荧光探针 1)线粒体(Mitochondria)

a. Rodamin 123 505/534，可染活细胞，阳离子性,可 检测线粒体膜电位,且在多数细胞中停留时间短

B. JC1线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光 线粒体膜电位高时为多聚体 490/590 发红光

标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电位最佳探针

c. Mitotracker Green FM 490/516,染活细胞或固定细胞,稳定不漏出

d. Mitoracker Orange CMTMRos 551/576,(氧化型) Mitoracker Orange 还原型,只能染活细胞 2)溶酶体 (Lysosome)

a. 中性红 541/640 微偏碱性,可标记溶酶体等酸性器官，为非特异性

b. AO :

LysoTracker Green DND-26 504/511,染活细胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red

3)内质网 (Endoplasmic Reticulum)

DiOC6 484/500: 非特异性,较高浓度标记内质网, 较低浓度标记线粒体

4)高尔基体 (Golgi apparatus)

NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死细胞 适用于线粒体的荧光探针较多，如Mitotracker、DA SPMI、DA SPEI、JC-1、Rhodamine 123等。

高尔基复合体常用的荧光探针有NBD ceramide、BODIPY ceramide。 内质网主要用DiI、DiOC6(3)。

溶酶体的荧光探针有LysoTracker类、DAMP、neutral red。 通过选择不同标记物，同时显示细胞的三部分结构。 Spectral imaging

检测细胞凋亡（apoptosis） what’s apoptosis?

原文是希腊文，apo的意思是从?，ptosis的意思是落下。apoptosis原意表示树叶从树木上落下。希腊语中正是花儿凋谢，树叶落下的景色。

凋亡与坏死不同，是指由基因调控的细胞主动性死亡过程，是多细胞体保持细胞平衡的重要生理机制。表现为细胞内特殊的“死亡基因”被激活，表达并激活依赖钙和镁的某些核酸内切酶，将细胞染色质以核小体为单位切断， DNA电泳时能形成特征性的200bp阶梯。

细胞凋亡的生物学特征 形态学变化

表面微绒毛消失，脱离周围细胞 胞浆脱水、体积缩小、固缩

内质网扩张与胞膜融合形成膜表面芽状突起（出芽）

核固缩成团、染色质集中分布在核膜的边缘呈新月性、马蹄形。称染色质边集

胞膜内陷分割包裹胞浆形成泡状小体。称凋亡小体（细胞凋亡的特征之一）

凋亡小体形成后迅速被吞噬细胞清除，没有细胞内容物外漏、不伴有炎症反应。 生物化学变化 DNA片段化

核酸内切酶的激活

脂质和凋亡相关蛋白改变 细胞凋亡的过程及机理 接受凋亡信号

凋亡调控分子间的相互作用

蛋白水解酶（caspases）的活化 凋亡的级联反应

细胞凋亡的信号转导通路

死亡受体信号通路 线粒体信号通路 内质网信号通路

细胞凋亡的信号转导通路 ? 细胞凋亡的生理意义 ? 确保正常发育、生长 ? 维持内环境稳定 ? 发挥积极的防御功能

所以细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，是医学界的关注热点。

生理性细胞凋亡的作用 1. 确保正常发育、生长

在器官、组织的形成、成熟中发挥作用

(细胞团 具备复杂结构的组织器官)

激光扫描共聚焦显微镜主要用于观察荧光标记的凋亡细胞形态、检测凋亡的进程及测定活细胞凋亡过程中钙的变化等。

具体方法有：观察细胞膜、核形态、凋亡小体、检测DNA断端的TUNEL及凋亡早期细胞膜损伤的Annexin-V法等 1.细胞核形态观察

常用标记DNA的荧光探针：

Hoechst33342, Hoechst33258, DAPI; 标记DNA RNA的AO和PI：

观察结果：可见凋亡细胞的细胞核区染色质浓缩，DNA凝结而成的凋亡小体等。未经RNA酶消化的细胞，用AO和PI标记后，还可以显现出细胞的整体轮廓，可以看到凋亡细胞的出芽，变形等现象。 2.脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法

（terminal-deoxynucleotide transferase mediated d-UTP nick end labeling,TUNEL）:

用于观察DNA的断裂，适于检测固定细胞，组织切片等样品。在细胞凋亡过程中，染色体DNA的断裂是个渐进的过程。DNA双链或只要一条链上出现缺口，即可产生一系列DNA的3’－OH末端，在DNA末

端转移酶或聚合酶的作用下，将荧光标记的脱氧核苷酸掺入到双链或单链DNA的3’－OH末端。因此，FITC的绿色荧光就可以显示出断裂位置，细胞上绿色斑点越大，说明其断裂的3’－OH末端越多； 凋亡时染色体断裂的原理

3.Annexin －V法检测凋亡：

原理：在凋亡的早期阶段，变化主要发生在细胞的表面。此时,虽然细胞膜的完整性尚还维持，但膜磷脂已失去平衡。位于细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）会从细胞膜的内侧翻转到外侧。而Annexin-V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂具有高度亲和力，可与PS结合，从而在早期凋亡细胞还未出现形态学改变及DNA降解以前，即可与通过Annexin-V荧光染料检测到。所以，在凋亡早期，仅可见到细胞膜上被染成绿色；凋亡中期，Annexin-V进一步与胞浆内的PS结合，可见细胞膜和胞浆均被然成绿色。一般与PI结合使用，PI是不能透过细胞膜的核酸染料，但对于凋亡晚期的细胞和死细胞，能透膜而使其染红。因而，Annexin-V与PI配合使用，能将凋亡细胞与死细胞鉴别开来，并且可以初步确定细胞凋亡进程。

优点：能定性、定量、原位检测活细胞的凋亡进程，并区分出正常细胞和死亡细胞。节省细胞和试剂。操作简单，省时省力。 重点内容回顾

荧光探针的用途：

1.蛋白质、单糖和多糖探针 2.细胞器探针 3.核酸探针

4.细胞活性探针 5.膜和受体探针

6.细胞膜电位和细胞内pH探针 7.金属离子探针

8.分子的特殊基团结合探针和其它

荧光样品的制备注意事项

依据试验目的选择合适的荧光探针及染色策略

例如：Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进入细胞标记DNA，也可以标记死细胞；而PI则不具备透膜性能，只能

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