脂多糖诱导小鼠肝损伤介质水平变化及五灵胶囊的作用(2)

　　2  方法

　　2.1  LPS诱导小鼠肝损伤血清酶实验取昆明小鼠96只，随机分成3组（每组设4个时间点：3，6，12，24 h ）：正常组、LPS组、五灵胶囊组，每组每时间点8只。正常组和LPS组分别ig蒸馏水10 ml/kg，五灵胶囊组ig五灵胶囊2.0 g/kg，各组小鼠ig给药1次/d，连续给药5次，小鼠禁食自由饮水，末次给药2 h后正常组各时间点小鼠尾静脉注射(iv) 生理盐水2 ml/kg，其余2组各时间点小鼠iv LPS 3.5 mg/kg，iv后分别于3，6，12，24 h眼眶取血，放置30 min，离心，分离血清，酶法测定TRIG，ALT，AST，ALP。

　　2.2  肝组织内MDA、TRIG、 NOS测定和免疫组化实验迅速取上述实验小鼠肝脏剔去胆囊，用冰冷生理盐水洗去血渍，滤纸吸干水分，除肝大叶外的肝组织制成10%肝匀浆，10 000 r/min离心，取上清按试剂盒说明书测定MDA、TRIG、NOS：肝大叶用10%甲醛（0.01 mol/L）磷酸缓冲液固定48h，石蜡包埋、切片，脱蜡至水洗,分别与抗CD14、抗TNF-α、抗iNOS、抗eNOS（1∶100）进行孵育，按试剂盒操作说明进行免疫组化反应，用二氨基联苯胺（DAB）-0.3 ml H2O2 /L系统显色10 min。苏木素衬染、脱水透明后，中性树胶封片。阴性对照片用PBS替代一抗。结果评定：标本无明确阳性反应者为阴性，在40倍镜下以Miaspro图象分析系统程序扫描染色阳性细胞,每只小鼠肝组织扫描5个视野计数阳性细胞，结果以阳性细胞率表示。

　　2.3  统计学处理采用SPSS10.0版统计软件，所测数据以（±s）表示，采用单因素方差分析。

　　3  结果

　　3.1  LPS诱导小鼠肝损伤不同时间血清酶的变化及五灵胶囊的作用血清酶学测试结果显示，小鼠 iv LPS后3 h血清ALT值上升最高，随着时间的延长其值逐渐下降，在24 h ALT值有所降低但仍明显高于正常组，AST水平3 h升高，12 h达最高，24 h下降仍明显高于正常组；ALP 3 h明显下降，随着时间的延长其值下降更低。与LPS组比较，五灵胶囊组3h血清ALT和AST值高于LPS组，6 h与LPS组一致，12 h明显低于LPS组，24 h继续下降，五灵胶囊对LPS导致小鼠肝内ALP下降无作用。见表1。表1  肝损伤小鼠不同时间血清酶的变化及五灵胶囊的作用（略）

　　3.2  对LPS诱导肝内MDA，TRIG，NOS含量影响小鼠iv LPS后3 h，与正常组比较，肝内MDA含量升高，12 h显著升高并达到高峰，24 h下降但明显高于正常组(P<0.05)。小鼠LPS攻击后3 h肝内TRIG含量无变化，6 h TRIG值上升(P<0.05)，12 h达到最高，24 h下降但仍明显地高于正常组(P<0.05)。肝内NOS在3 h上升，12 h达最高(P<0.05)，24 h降至正常。与模型组比较,五灵胶囊组各时间点MDA含量均明显低于LPS组。对LPS诱导小鼠肝内TRIG和NOS含量增加无降低作用,见表2。表2  LPS诱导肝内 MDA，TRIG，NOS水平变化及五灵胶囊的作用（略）

　　3.3  对LPS诱导肝内TNF-α，CD14，iNOS，eNOS表达的影响免疫组化染色结果显示，正常小鼠肝组织表达微量的TNF-α，CD14，iNOS，eNOS，在不同的时间段内阳性表达率大致恒定。与正常组比较，小鼠iv LPS后不同时间点肝组织内TNF-α阳性表达率持续急剧升高(P<0.05)；CD14在3 h阳性表达率最高，6 h有所下降，12 h和24 h又显著升高(P<0.05)；iNOS，eNOS阳性表达率高于正常值3倍，6 h和12 h下降，24 h显著升高。五灵胶囊在12，24 h可明显地降低TNF-α， CD14，iNOS，eNOS阳性表达率。见表3。表3  LPS诱导肝内TNF-α，CD14，iNOS，eNOS阳性表达的变化及五灵胶囊的作用（略）
　
　　4  讨论
   
　　以往研究显示LPS致肝损伤机制主要是通过激活 KC释放TNF-α，IL-1，IL-8，PAF等细胞因子和介质诱导肝细胞损害，同时也引起肝细胞各种代谢功能改变。有研究发现体内注射LPS后肝细胞蛋白合成、糖代谢均受影响，最终可导致动物死亡。本试验显示小鼠iv LPS后3h，ALT和AST水平明显升高并持续至12，24 h下降但仍显著高于正常，ALP值则与前二者相反而明显地降低，随着时间的推移而逐渐降低，肝细胞损伤严重ALP值就愈低。小鼠iv LPS后3h肝内MDA，NOS和TRIG值升高并不显著，6、12 h 3指标含量明显增加，24 h MDA和TRIG值仍高于正常组，NOS下降至正常。小鼠iv LPS 3h血清酶ALT与AST明显升高，表明肝细胞损伤开始，肝内MDA、NOS和TRIG并未急剧升高，提示在3h内反应肝损伤血清酶水平的上升与三介质无关；在6，12，24 h肝内MDA 、NOS 与TRIG值明显增加，血清ALT与AST水平也显著升高，肝内脂质代谢紊乱，提示在此时三者参与肝损伤。卞建明等［4］发现TNF-α对肝细胞DNA的代谢呈双相调节，低浓度TNF-α有刺激DNA合成的作用，而高浓度的TNF不但使DNA合成受阻，还造成肝细胞损伤，TNF-α可通过抑制线粒体呼吸链复合物而使肝细胞能量代谢障碍［5］。CD14是KC表面存在的受体，在LPB存在下CD14与LPS结合并迅速与细胞膜上其他具有信号转导能力的LPS相关受体如TLR2，β2整合素、L-selectin等结合形成复合物，将LPS转递给这些信号转导分子介导KC激活分泌炎性细胞因子。诱导型NO合酶（iNOS）在生理情况下表达微量，只有在LPS和某些因子诱导下肝实质和非实质细胞才大量生成，从而产生持久的生理效应［6］。本实验显示组织中TNF-α ，CD14，iNOS，eNOS 阳性表达率在3～24 h持续高表达，与肝功酶水平波动一致，肝组织iNOS、eNOS阳性表达率与肝内总NOS的结果趋向一致。提示这些因子与介质参与了肝损伤过程。五灵胶囊对3 h肝功酶酶水平无作用，至6 h逐渐影响LPS所致小鼠肝损伤，各肝功酶酶水平下降，至12 h产生明显的抑制作用，提示五灵胶囊并非直接作用血液内肝功酶而使酶水平下降，而是作用于LPS损伤肝细胞的某些环节而降低ALT和AST水平。ALP来自细胞器功能酶，五灵胶囊不能阻止ALP下降提示其对LPS所致细胞器损伤无作用。五灵胶囊在12，24h明显降低MDA和NOS含量，TNF-α、 CD14、iNOS、eNOS阳性表达率下降，同时AST、ALT酶水平也相应下降，提示五灵胶囊抑制LPS所致肝损伤与降低炎性因子和介质有关。实验发现小鼠iv LPS后甘油三酯（TG）则急剧上升，TRIG升高可能是LPS导致清道夫受体下调，干扰血清脂蛋白在肝内修饰，甘油三酯在肝内代谢的改变导致血清中TRIG升高，另一种可能是LPS引起胰岛素抵抗造成脂质紊乱，五灵胶囊不能抑制LPS诱导小鼠体内TRIG升高，其原因有待进一步研究。

百度搜索“70edu”或“70教育网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，70教育网，提供经典医药类脂多糖诱导小鼠肝损伤介质水平变化及五灵胶囊的作用(2)在线全文阅读。