2.3 PCR引物设计
根据GeneBank上公布的土曲霉和红曲霉洛伐他汀生物合成基因簇（登录号为AF141925和DQ176595）中lovE和mkH基因设计如下引物扩该基因。lovEF: ATGGCTGCAGATCAAGGTATAT；lovER: TCATGGAGGAATATTGTTGAGG；预期lovE产物大小为1 512 bp。mkHF: TTAGGAGGCCAGGTTGTGTTGG；mkHR: ATGGCCCTATCGCCAGTCCAGG；预期mkH产物大小为1 464 bp。
2.4 PCR反应
反应体系：10×buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl2 1. 2 μL,10 μmol/L dNTPs 0.4 μL,20 μmol/L 引物组各0.4 μL，ddH2O 14.5 μL，DNA 1 μL，Taq酶 0.1 μL。总体系20 μL。
热循环条件：94 ℃预变性5 min后，以94 ℃30 s，50 ℃20 s，72 ℃1 min 40 s程序循环40次，延伸72 ℃20 min。
2.5 目的片段的克隆与测序
1%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再按胶回收试剂盒操作回收纯化PCR产物。按pMD19T simple载体1 μL，回收DNA4 μL，solutionⅠ（含T4连接酶和连接酶缓冲液）5 μL的比例轻轻打匀于16 ℃水浴连接2 d。大肠杆菌DH5α感受态制备及转化均按分子克隆指南方法操作。克隆片段交由英俊生物技术有限公司双脱氧法双向测定并拼接。
2.6 转化子验证
蓝白斑筛选挑取白斑单克隆菌落PCR验证。
反应体系：10×buffer 1 μL，25 mmol/L MgCl2 1. 2 μL,10 μmol/L dNTPs 0.2 μL,20 μmol/L 引物组各0.2 μL，ddH2O 7.15 μL，DNA 无菌枪头蘸取，Taq酶 0.1 μL。总体系10 μL。
热循环条件：94℃预变性5 min后，以94 ℃30 s，50 ℃20 s，72 ℃1 min40 s程序循环30次，延伸72 ℃ 5 min。
2.7 序列分析比对
采用DNAMAN软件将测序结果与GeneBank已知序列进行比对，并通过NCBI等网络资源分析基因序列及其对应蛋白的理化性质、高级结构和功能。
3 结果与分析
3.1 PCR扩增结果
见图1，表明对lovE和mkH扩增得到与预期大小一致的产物，约为1 500 bp。
M为DNA Marker DL2000（从上至下分别是2 000 bp，1 000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）；0为阴性对照即没加模
图1 PCR扩增结果（A为lovE，B为mkH）（略）
Figure 1 Electrophoresis of PCR products on 1% agarose gel（A for lovE and B for mkH）
3.2 菌落PCR验证结果
见图2，对lovE和mkH扩增得到了与预期大小一致的产物，约为1 500 bp。
A图中M为DNA marker 100 bp ladder（从上至下分别是1 500 bp，1 000 bp，900 bp，800 bp，700 bp，600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp）；B图中M为DNA Marker DL2000（从上至下分别是2 000 bp，1 000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）；0为阴性对照即没加模板DNA；A图中1-9是lovE的菌落PCR扩增结果；B图中1-6是mkH的菌落PCR扩增结果
图2 菌落PCR结果（A为lovE，B为mkH）（略）
Figure 2 Electrophoresis of colony PCR products on 1% agarose gel（A for lovE and B for mkH）
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