1.4 神经功能缺损评分
参照BEDERSON 等[4]5分制法进行评分。评分累积1分以上认定为造模成功。
1.5 脑组织病理观察
每组随机选取4只大鼠，心脏灌注生理盐水、40 g/L 多聚甲醛各约200 mL，断头取脑，取前囟后3～6 mm部位组织，40 g/L 多聚甲醛后固定,脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，片厚5 μm。HE染色后镜下观察组织病理学变化。
1.6 HIF1α蛋白检测
采用SABC法。SABC试剂盒、兔抗鼠HIF1α单克隆抗体（一抗）购自武汉博士德生物工程有限公司。大鼠水合氯醛麻醉后，心脏依次灌注生理盐水、40 g/L多聚甲醛各约200 mL，断头取脑，取前囟后3～6 mm部位组织，多聚甲醛后固定4 h，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，片厚5 μm。每只动物取3张切片，常规脱蜡至水。体积分数0.03的H2O2灭活内源性酶，抗原热修复，滴加1∶200工作浓度的HIF1α单克隆抗体。4 ℃过夜后，依次滴加生物素化二抗、试剂SABC，37 ℃各孵育30 min，DAB显色，镜下控制反应时间。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。参照文献[5]的方法进行观察。
1.7 图像分析
采用Simple PCI显微图像分析系统进行图像分析，测量免疫组化染色的平均吸光度（A）值。
1.8 统计学处理
采用SPSS 11.5软件包进行统计学处理，检测结果以±s表示。各组同一时间点之间比较采用t检验，组内不同时间点比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 神经功能缺损评分
SS+SS组神经功能评分为0。IP+MCAO组3、7 d神经功能评分均低于SS+MCAO组，差异具有统计学意义（t=4.025、2.683，P＜0.05）。 SS+MCAO组中各时间点间比较差异无显著性；IP+MCAO组中3 d与其他时间比较，差异具有显著性（F=3.55,P＜0.05）。见表1。表1 各组动物不同时间点神经功能缺损评分比较
2.2 病理学观察
2.2.1 大体改变 缺血侧大脑表面呈不同程度的饱满、苍白等脑水肿征象。
2.2.2 光镜观察 SS+SS组神经细胞的数量及形态分布正常。SS+MCAO组与IP+MCAO组海马区均表现不同程度的损伤改变，如细胞数减少、形态肿胀，细胞排列紊乱。梗死灶中心区组织明显稀疏，神经细胞出现脱失及变形，胞核固缩、溶解，失去完整结构。梗死灶周边区神经元、神经胶质细胞肿胀，甚至胞核固缩、浓染，并可见胶质细胞浸润。IP＋MCAO组梗死灶中心区较SS+MCAO组明显减小，周围区结构完整的神经细胞明显增多，组织水肿程度减轻；海马区细胞数量减少不明显，排列相对规整（图1、2）。
2.3 HIF1α的检测
光镜下HIF1α阳性细胞为胞核或胞浆呈棕褐色或棕黄色。SS+SS组偶尔见少量HIF1α蛋白表达。 IP+MCAO组与SS+MCAO组可见较多的HIF1α阳性表达细胞，主要分布于皮质、海马、纹状体及室管膜细胞等，神经元与胶质细胞均有表达（图3、4）。IP+MCAO组1、3、7 d的HIF1α蛋白表达水平与SS+MCAO组相应时间点比较，差异具有显著性（t=2.449～9.898，P＜0.05）。见表2。 表2 各组HIF1α蛋白的表达
3 讨 论
脑缺血耐受是指给予短暂的亚致死性缺血后诱导脑的内源性保护机制,从而对后续长时间缺血损伤产生耐受及自身保护作用[1]。HIF1是近年发现的一种转录因子，由α、β两个亚基组成 ，α既是调节亚基，又是活性亚基，O2对 HIF1 活性调节主要通过对该亚基的影响实现。低氧时 HIF1 两个亚基形成二聚体，可与许多靶基因的低氧反应元件结合，介导机体的低氧反应，在低氧诱导的基因表达中起到关键作用[6～9]。近年许多研究表明，HIF1α与脑缺血关系密切，在缺血低氧性脑损伤中发挥重要作用。SHARP等[10]研究结果显示,局灶性脑缺血发生 7.5 h 后,mRNA编码的HIF1α、GT1及一些糖酵解酶在梗死周边区开始诱导出现,19及24 h时其表达被进一步上调。BERGERON等[11]研究也认为,在急性局灶性脑缺血时HIF1α及相关基因表达上调促进了梗死灶周边血管网的重塑和糖酵解,有助于缺血脑组织的存活。
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