1.3 IL21重组表达质粒的构建
利用含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物，经PCR获得IL21成熟肽的编码基因。经过纯化的PCR产物及载体pGEX4T2同时用核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ消化后以T4连接酶连接，构建原核重组表达质粒。对用TSS法新鲜制备的感受态E.Coli.DH5α进行转化。对转化长出的菌落进行质粒小提，用限制性内切酶进行初步鉴定后，进行DNA序列测定分析。
1.4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
挑取单个重组成功菌落接种于5 mL AmpLB中, 37 ℃震荡培养,当菌液吸光度达到0.4～0.6时,用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导目的基因在大肠杆菌DH5菌中的表达。分别于诱导后1、2、4 h取菌液3 mL，12 000 r/min离心1 min，沉淀用SDS凝胶加样缓冲液震荡后置沸水浴5 min，稍微离心，上清移至新管,-20 ℃储存备用。同时，用DH5α宿主菌和未诱导的含重组质粒的DH5α菌，以及诱导的含pGEX4T2质粒的DH5α菌样品作对照行SDSPAGE。
1.5 表达蛋白的纯化和Western Blotting分析
根据37 ℃时蛋白表达情况，降低细菌的诱导温度到23 ℃进行大体积低温诱导3 h。收集菌液，经离心后，将菌斑用适当体积的PBS液洗涤两次后再次重悬，冰浴下超声裂解细菌。4 ℃，14 000 r/min离心10 min分离上清。将上清中加入GST Fusion Protein Purification bead震荡30 min纯化浓缩上清中的蛋白。将诱导的菌体、纯化的融合蛋白进行SDSPAGE电泳，电泳后用BioRad公司的电转仪将蛋白转至PVDF膜上。电转结束后将膜在丽春红染液中染色，用铅笔标记出蛋白Marker。然后，参照分子克隆实验操作。一抗为IL2的单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。
2 结 果
2.1 目的基因的PCR扩增
PCR扩增的IL21全编码基因长为642 bp，其中成熟N端编码基因长为396 bp。同DNA标准相对分子质量参照物相比，PCR扩增产物的大小与预测的结果一致（图1）。
2.2 原核重组表达质粒的鉴定
经PCR扩增出的IL21成熟肽的编码基因片段和鉴定重组成功的质粒经双酶切后同时进行电泳，可见酶切产物和PCR扩增条带大小与理论
值相符（图2）。
2.3 表达蛋白的SDSPAGE
经SDSPAGE，考马斯亮蓝R250染色观察，含重组质粒的诱导菌在相对分子质量为41 000位置出现一蛋白条带，而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置没有蛋白条带；含质粒pGEX4T2的诱导菌在相对分子质量为26 000位置出现一条带。目的基因表达的多肽相对分子质量估计为15 000，与融合蛋白共同表达相对分子质量约为41 000的多肽，与理论估计相一致。经凝胶成像扫描，融合蛋白产量占总蛋白的10%（图3）。
2.4 表达蛋白的纯化
大体积蛋白表达后，将细菌裂解液上清和纯化浓缩的蛋白进行电泳分析，结果显示得到理想的纯化融合蛋白条带(图4)。 2.5 表达蛋白的Western Blotting检测鉴定
将纯化的融合蛋白进行SDSPAGE，电泳后作Western Blotting分析，结果可见有与理论相符的条带（图 5）。
3 讨 论
人IL21是IL2家族中的新成员，主要由活化的CD+4 T细胞产生，与IL2、IL15、IL4等细胞因子具有高度同源性。其基因定位于4q2627, 距离IL2 基因约180 kb。结构分析表明，成熟的人IL21 含有四螺旋族细胞因子结构域,该结构域与IL2、IL4、IL15 的四螺旋族细胞因子结构域有较高的同源性。IL21 与IL15 在相同的位置有两对相同的半胱氨酸, 其中一对在IL2、IL4中具有保守性。最近通过核磁共振技术获得的高精三维结构表明，人IL21有不同的同工异构体，并在细胞实验中呈现十分不同的活性[6]。
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