1.2 方法
1.2.1 重组真核表达载体的构建 在原构建的重组质粒pALTERCD59的基础上, 设计两对反向互补、含有突变位点的引物及一对通用引物，由生物公司合成。其序列如下。通用引物pT7：5′TAATACGACTCACTATAGGC3′；通用引物T3：5′TATTCAGGCGTAGCAACCAG3′ ；突变引物M/F：5′GTGTATAACAAGTGGTGGTGGTTTGAGCATTGC3′； 突变引物M/R：5′ATGCTCAAACCACCACCACTTGTTATACACTTG3′。 以已构建的CD59 cDNA重组质粒为模板，以常规引物pT7和诱变引物M/R进行PCR1反应，以已构建CD59 cDNA重组质粒为模板，以常规引物T3和诱变引物M/F行PCR2反应，将纯化PCR1和PCR2产物等量混合为模板，以通用引物pT7和T3行PCR扩增反应，从而得到所需的诱变位点的大量DNA片段，该突变可使CD59第39～41位氨基酸均突变为色氨酸。经琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，并回收目的条带。将质粒pALTER及含有全长突变CD59基因的PCR产物用EcoR Ⅰ单酶切后，经T4 DNA连接酶作用，使突变基因插入到pALTER 质粒的EcoR Ⅰ位点, 以构建重组真核表达质粒。用TSS法使重组质粒转化感受态的细菌JM109，经氨苄青霉素筛选后，挑取单个菌落用酚抽提法提取质粒，以EcoR Ⅰ酶切鉴定。对筛选的克隆进行序列测定，由上海生物工程有限公司完成。
1.2.2 Hela细胞的转染及阳性克隆的筛选 重组质粒的转染参照 LipofectamineTM2000的说明书进行。转染后24 h，将细胞按1∶10稀释传代，24 h后加入含有800 g/L G418的选择性培养基，筛选2周后套取单克隆并继续筛选2周，扩大培养始终维持G418在400 g/L。连续传代10次后，收集细胞进行鉴定。
1.2.3 Hela细胞中突变CD59的检测 ①免疫荧光技术: 刮取细胞, 离心去上清, 用PBS洗3次。涂片、干燥后, 用乙醇固定后晾干, 加入鼠抗人CD59单克隆抗体，37 ℃孵育30 min, 洗涤后加入羊抗鼠的FITCIgG二抗，于37 ℃孵育30 min，洗涤，干燥后在荧光显微镜下观察结果。②ELISA法：收获并裂解细胞,测定并调节标本和对照蛋白质质量浓度为5 mg/L,用包被液以1∶1、1∶2、1∶4 稀释待测标本和空白PALTER 对照,并分别设6个复孔,每孔加入100 μL样品,4 ℃包被18 h,封闭,加入鼠抗人CD59抗体后,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,然后加底物显色液（邻苯二胺）显色,测定495 nm处吸光度（A）值。③流式细胞术：刮取转染突变CD59的细胞株(5×108/L)，加入FITC抗人CD59单克隆抗体，设置野生Hela细胞为对照，实验组及对照组均设定FITCIgG二抗，同型对照，上机检测。
1.2.4 肿瘤逃逸相关分子caspase3的检测 用免疫组织化学法检测转染突变CD59后Hela细胞内caspase3表达的变化，操作按照caspase3免疫组化试剂盒使用说明书进行。用Imageproplus 5.0软件对所得图片进行吸光度测量。
1.3 统计学处理
数据间比较采用t检验。
2 结果
2.1 重组质粒的鉴定
以EcoR Ⅰ酶对重组质粒进行酶切,获得1条496 bp的电泳带,与所插入的片段的大小相一致(图1)。测序结果表明,突变CD59pALTER含有突变CD59的全长cDNA序列。见表1。
2.2 荧光免疫组化检测
荧光显微镜下可见转染突变CD59的Hela细胞表面的荧光亮度明显强于未转染突变CD59的Hela细胞。
2.3 ELISA检测
转染突变CD59的Hela细胞裂解产物的CD59蛋白表达量明显高于Hela对照组，差异有显著性（t=3.195～4.842,P<0.01）。见表2。
2.4 流式细胞术检测
转染突变CD59的Hela细胞的CD59表达率为78.32%（图2）。
2.5 转染前后Hela细胞内caspase3的表达变化
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