支气管肺泡灌洗液实时荧光定量PCR检测诊断不典型肺结核

                     作者：李钋 邢岚 陈晓艳 马慧 侯秀峰 田永丽

【关键词】支气管肺泡灌洗液  实时荧光定量PCR  结核分枝杆菌  不典型肺结核
        肺结核是呼吸科常见疾病，目前肺结核的诊断金标准是痰菌阳性，菌阴肺结核的诊断缺乏金标准，我们采用实时荧光定量PCR技术检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的结核分支杆菌DNA，并与涂片和培养法比较，以评价实时荧光定量PCR检测BALF中结核分支杆菌在不典型肺结核诊断中的价值。
        1  材料与方法
        1.1研究对象  我院已经临床确诊的住院肺结核患者18例。依据结核中毒症状，细菌学或病理学检查，结合X线、CT表现及(或)抗结核治疗，随诊3～6个月病灶逐渐吸收而确诊。另选20例本院住院的非结核肺部疾病者作为对照。其中急慢性支气管炎11例，肺炎5例，肺癌4例。
        1.2研究方法  所有病例结合肺CT按病变部位选择灌洗肺段，应用电子支气管镜检查并行经支气管镜防污染支气管肺泡灌洗术（PBAL），并对所取标本即时做PCR检测，涂片查结核分支杆菌和结核分支杆菌培养。 
        1.3检测方法  支气管肺泡灌洗液涂片作抗酸染色镜检，结核分支杆菌培养及菌型鉴定按照中国防痨协会结核病细菌学检测方法进行。实时荧光检测PCR检测：结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测试剂盒，由中山大学达安基因股份有限公司生产，FQ-PCR仪为美国MX3000P基因扩增仪，操作步骤严格按照说明进行。
电子支气管镜采用OLYMPUS CV260型，消毒方法：全自动消毒清洗机清洗。
        1.4统计学方法  采用x2检验。P＜0.05具有统计学意义。
        2  结果
        结核组与非结核组BALF三种方法检测结果：肺结核组患者BALF涂片、培养及PCR的阳性率则分别为11%（2例）、17%（3例）及61%（11例）。本组病例的PCR结果分别与涂片和培养比较，差异有显著性，x2检验示P＜0.01。非肺结核组中BALF PCR阳性1例(5%)。        3  讨论
        肺结核是一种感染性疾病，病因明确，目前实验室诊断是确诊结核病的主要依据。涂片法简单、快速、经济，但灵敏性差，检出率低，通常5000-10000条菌/ml才能得到阳性结果，且不能将结核杆菌与其他分枝杆菌区分开来。培养法一般要4-8周，快速培养也要2周。荧光定量PCR是近年用于临床病原菌检测的一种具有高灵敏性、高准确性、高特异性、定量范围宽、操作简便、快速安全、污染最少的可靠的DNA体外扩增技术。荧光定量PCR法能稳定检测10copies结核杆菌基因组DNA，灵敏度高。随着分子生物学技术的开展，荧光定量PCR技术把核酸扩增、杂交及光谱技术结合在一起，在封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性，利用特异性探针，实时监测，与自动分析一体化，实现精确、特异、简便、快速的检测。本组病例中支气管肺泡灌洗液直接取材于病灶处支气管肺泡内，细菌浓度高，污染几率低，且无痰患者也可以检测。我们采用FQ-PCR法检测BALF中的TB-DNA，肺结核组阳性率为61%，显著高于BALF涂片及培养（P＜0.05）；非肺结核组阳性率只有5%。表明FQ-PCR仍有假阳性结果，但较PCR检测明显降低（国内有报道17.64%[1]）。由于PCR不能区分死菌与活菌，对于治愈的肺结核，如果肺内有死的结核杆菌，仍可抽提到DNA，PCR检测仍可为阳性，此时对病情的判断应该结合临床其他检查结果综合判断。

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