Figure 5 Nterminal 15 amino acid residue sequencing of 16 kDa subunit 本研究采用SDSPAGE电泳方法，对组成类凝血酶Agacutin的16和15 kDa亚基进行了分离。通过切割分离含2个亚基的胶条，电洗脱回收，得到了单一亚基条带，并转移至PVDF膜进行了成功测序。从SDSPAGE图谱可知，该蛋白质的15和16 kDa两亚基非常相近，如果一种测序样品混合了很少量的另一种亚基肽链，测序结果可能不可靠。此外，拆分和测序结果成功与否，还取决于回收样品的鉴定结果和量。鉴于方法学的限制，本来就极少量的亚基纯品，在资金和仪器条件限制下，其鉴定过程就更加困难。本文通过SDSPAGE、亚基胶条回收和电转移技术相结合，简单地解决了这样的测序问题，即使纯化样品纯度不高，该方法也很有效，所以该亚基分离方法和测序有一定的实际意义。
SDSPAGE分析显示，Agacutin是一个15和16 kDa亚基组成的异二聚体。大亚基N端15个氨基酸残基序列为DCSSGWSSYEEHQYY和小亚基序列为DSSGWSSYEGHEYYV。通过NCBI Blast序列比较分析，15和16 kDa亚基分别与凝血因子X结合蛋白Agkisacutacin的A链有最大66.7%和73.4%的序列同源性(GenBank accession no.1WT9 A [gi / 93278427], Chain A, Crystal Structure of AaXBpI, A snake venom protein from Deinagkistrodon acutus snake venom)。
按照新药申报模式，I类新药的蛋白质药物，必须测定N端15个氨基酸残基，以确定它是否是新的蛋白质。因为这样的N端序列完全同源有10-15可能性，所以该测序结果可直接为该化合物的申报奠定坚实的基础。另外，在该蛋白/基因的全序列未得出前，不能获得很多有益的信息。因为，对于接近300个氨基酸残基的蛋白质来说，N端15个序列显得太少。
蛋白亚基之间多由比较复杂的键相连接，主要有二硫键、离子键、疏水键等。在还原电泳条件下，Agacutin亚基间的化学键被破坏，各亚基根据自身分子量大小排列而得到分离。本研究正是借助这种机理，将2个非常相近的亚基分离，并转移到PVDF膜上，通过切割含目的蛋白条带测序。
致谢:该研究工作获得昆明龙津药业公司资助,在此表示感谢!
【参考文献】
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