尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序

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作者：唐松山，唐治华，李红枝，游娟

【摘要】 目的测定Agacutin两个相近亚基的N端15个氨基酸残基序列，酶分子的2个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序。方法通过生物化学方法获得高纯化Agacutin，经SDS-PAGE电泳分离、亚基胶条回收及PVDF膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品，后者通过Edman降解法，测定了亚基N端15个氨基酸残基序列。结果大亚基(16 kDa)的序列为：DCSSGWSSYEEHQYY，小亚基(15 kDa)序列为DSSGWSSYEGHEYYV。结论测序结果经NCBI 数据库检索发现，Agacutin为新的蛇毒类凝血酶。

【关键词】 尖吻蝮蛇蛇毒; 类凝血酶; 亚基拆分; 蛋白N端测序

　　Abstract:Objective To sequence Nterminuses of the close two subunits of Agacutin,the separation of single subunit was completed for the sequencing.Methods The single subunits of Agacutin were obtained by using SDSPAGE,subunit gel recovery and electrical transfer technique. The Edman degradation method was used for the sequencing.Results The subunit sequences of the 16 and 15 kDa were determined to be DCSSGWSSYEEHQYY and DSSGWSSYEGHEYYV,respectively.Conclusion According to above sequencing results,the NCBI Blast comparison showed that Agacutin is a novel thrombinlike enzyme.

　　Key words:Agkistrodon acutus snake venom; thrombinlike enzyme; subunit separation; protein Nterminal sequencing.

　　蛇毒含有许多特殊蛋白酶和活性多肽,这些酶可能作为支持物质参与消化，并且也是蛇毒神经毒和出血毒的主要原因。自1995年以来，一系列对血液凝固系统起作用的结构和功能多样性的酶自尖吻蝮蛇蛇毒中被纯化。1995年,Chen YL等[1]纯化了Agkicetin(14和15 kDa的异二聚体)，它具有GP1b拮抗剂和血小板抑制活性;1998年,Yeh CH等[2]纯化了Accutin(5.241 kDa)，一个新的整合素成员，它潜在性地抑制血小板聚集;1999年，Huang QQ等[3]报道了类凝血酶AcuthrombinA(28 kDa)和AcuthrombinC(69 kDa);Cheng X等[4]纯化了纤维蛋白溶解酶Agkisacutacin(14和15 kDa的异二聚体);Pan H等[5]成功克隆了Acutin(38 kDa)，一个具有去纤化功能的类凝血酶;2000年，Xu XL等[6]报道了2个抗凝血类凝血酶ACFI (Anticoagulation FactorI)和ACFⅡ(Anticoagulation factorⅡ)(14.6和14.7 kDa的异二聚体);2001年,Yeh CH等[7]报道了血小板糖蛋白Ib拮抗剂Agkistin(16.5和15.5 kDa的异二聚体)和Liang XX等[8]报道了纤溶酶FⅡ(a)(26 kDa);2003年，郑颖等[9]纯化了2个类凝血酶;2004年,李婷等[10]纯化了抗凝血功能的类凝血酶(14.4和17 kDa的异二聚体); 吴忠和苏薇薇报道了具有止血活性的类凝血酶Halase[11,12]。

　　自1993年起，本课题组尝试从尖吻蝮蛇蛇毒中分离具有止血功能的类凝血酶。目前，已获得5个以纤维蛋白原为底物的酶，进一步的研究发现，至少有2个酶具有止血活性，Agacutin是被研究的最全面的一个。本文报道了Agacutin的亚基拆分和N端15个氨基酸残基序列测定。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂、TRIS和CAPS{3[Cyclohexylamino]1propanesulfonic acid} 购自Promega公司;PVDF膜为BioRad公司产品;可逆性蛋白质快速染色试剂盒为北京天为时代科技有限公司产品;Agacutin类凝血酶由昆明龙津药业有限公司提供;其余试剂为国产分析纯。

　　1.2 仪器

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