【摘要】 目的 探讨PTEN基因变异在原发性肝细胞癌(HCC)发生发展中的作用。方法 应用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术，对30例肝癌组织、30例癌旁组织和16例正常肝组织细胞中PTEN基因的表达情况进行了检测和分析。结果 肝癌组织中PTEN基因表达水平明显低于癌旁组织和正常肝组织（F＝6.785，q=4.269、4.549，P<0.05）。低分化肝癌组织中PTEN基因表达水平显著低于高、中分化肝癌组织 (t=3.266,P<0.01)。结论 PTEN基因失活与肝癌发生密切相关；PTEN基因表达水平与HCC恶性程度有明显相关性，提示其变异可以作为病人预后判断的指标。
【关键词】 基因 PTEN RNA 信使 癌 肝细胞 逆转录聚合酶链反应
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the role of PTEN variation in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma (HCC). MethodsSemiquantitive reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR) was adopted to detect the expression of PTEN gene in 30 HCC and their adjacent tissues as well as 16 normal liver tissues served as controls. ResultsThe expression level of PTEN gene in the HCC tissues was significantly lower than that in the adjacent and normal liver tissues （F＝6.785;q=4.269,4.549;P<0.05）. In lowlydifferentiated HCC tissue, the expression of PTEN was much lower than that in the highly and moderatelydifferentiated HCC tissues (t=3.266,P<0.01).ConclusionThe inactivation of PTEN is closely associated with the pathogenesis of hepatocellular carcinoma, and the expression of PTEN is highly related with the malignancy of the cancer, which suggests that the alternation of PTEN can serve as a prognostic predictor for this disease.
［KEY WORDS］gene, PTEN; RNA, messenger; carcinoma, liver cell; reverse transcriptase polymerase chain reaction
原发性肝细胞癌(HCC)是一种高发性恶性肿瘤，其发生发展涉及多基因、多分子水平的改变。 PTEN基因又称MMAC1或TEP1，是一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN蛋白在细胞的生长发育、信号传导、迁移、凋亡过程中起到重要作用。PTEN基因的突变和失活存在于多种肿瘤中，如神经系统、生殖系统及消化系统肿瘤等。国外有学者研究发现，肝癌组织中存在着PTEN基因的突变［1］，国内学者用免疫组化方法检测了PTEN蛋白在肝癌中的表达，发现肝癌组织中存在较高比例的PTEN蛋白的阴性表达［2］。目前，有关PTEN的研究集中于基因的缺失和突变，而对于基因的表达则研究得较少。本研究应用半定量RTPCR技术从mRNA水平检测PTEN基因在肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达情况，分析PTEN基因失活在肝癌发生中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
标本来自2001年12月～2002年12月青岛大学医学院附属医院及青岛市市立医院肝胆外科手术病人。30例HCC病人（HCC组），男22例，女8例，年龄33～71岁，平均52岁。术中取癌区、癌旁区（距癌边缘2～5 cm）组织标本。16例肝血管瘤手术病人为正常对照组（CON组），其中男11例，女5例，年龄35～59岁，平均52岁。术中取正常肝组织标本。所有标本均经病理学检查证实。
1.2 方法
1.2.1 组织总RNA提取及RTPCR检测PTEN表达 用Trizol法提取组织总RNA，水溶后将其反转录合成cDNA。PTEN基因引物如下。外显子1：5′CGA AGC TTC CAC CAT GAC CAT CAT CAA AG3′；外显子5：5′ATC AAA CCC TTT TGT GAA GA3′；外显子8：5′TCT ATA CTG CAA ATG CTA TC3′；外显子9：5′TTG GAT CCT CAG ACT TTT GTA ATT3′。分别以外显子1、5为上游引物，8、9为下游引物，进行18、19、58、59四种组合，用RTPCR法检测PTEN基因 不同片段在肝癌中的阳性表达率及表达水平。以甘油醛3磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参照（上游引物5′CTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA3′；下游引物5′ATG ATC TTG AGG CTG TTG TCA TA3′）［3］。PCR反应体积为25 μL，反应体系为10×Buffer 2.5 μL，MgCl2 1.5 mmol/L ， dNTP 0.1 mmol/L， Tap DNA聚合酶1.0 U，PTEN及GAPDH上下游引物各0.4 μmol/L，cDNA模板2 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，33个循环；72 ℃延伸10 min。
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