胡椒醇提液外用对兔耳冻伤的治疗研究(2)

　　兔耳冻伤后由于局部细胞发生变性或坏死，兔耳形态和组织结构会有所改变，变性的细胞如及时恢复供血供氧，清除损伤因子，能转为正常，反之，如持续缺血缺氧，则损伤可进一步加重，直至坏死。坏死表皮可由周围正常表皮再生修复，真皮坏死则只能通过肉芽组织填补修复，修复后兔耳形态和组织结构不能恢复正常；另外，因冻伤后机体氧化抗氧化系统平衡被打破，丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）这对反映组织氧化损伤程度与抗氧化能力的生化指标会发生相应变化；近年来肿瘤坏死因子α（TNF-α）在创伤和创伤修复中的作用越来越受人们关注。现已证实，在创伤修复早期TNF-α能诱导白细胞脱颗粒，增强其吞噬能力，加速肉芽组织及肉芽组织内新生血管形成［1～3］。在修复中、后期高浓度TNFα能抑制成纤维细胞胶原蛋白基因的转录,同时可以引起胶原酶基因转录的显著增加,因而TNFα在组织的重塑中具有重要意义，可减少瘢痕组织形成，提高修复质量［4，5］。也就是说，在创伤修复早期适当浓度的TNFα能加速创面修复，中、后期高浓度TNFα能提高修复质量［6］。该文通过观察冻伤兔耳治疗后外观形态与组织病理改变情况，测定血清和冻耳组织中MDA、SOD、TNF-α含量综合评价胡椒局部外用对兔耳轻度冻伤的治疗作用，进而研究胡椒抗冻疮的效果。

　　1  仪器与材料

　　1.1  仪器 

　　2010型酶标仪（奥地利Anthos Labtec Instruments公司）；756MC紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

　　1.2 试药 

　　取白胡椒（购自东骏大药房），用70%乙醇冷浸3次（48，24，24 h），合并浸提液，静置分层，过滤，滤液用70%乙醇配制为高、中两种浓度供试液，每毫升分别相当于生药3.30，1.65 g；MDA和SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为：20071228，20071227）；TNFα试剂盒（美国Adlitteram Diagnostic Laboratories公司，批号：RT110371）。

　　1.3 动物 

　　日本大耳白兔40只，体质量2.0～3.0 kg，雌雄兼用，由昆明医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（滇）2005-0008。

　　2 方法

　　2.1  冻伤模型复制与给药

　　［7］取家兔分为4组，即正常、溶剂和高、中浓度胡椒供试液组，每组10只，于实验室正常单笼饲养6 d后将右耳耳尖至耳根7 cm范围剪毛，隔日将右耳剪毛区域浸入（-15±1）℃冷冻液（6份碎冰+1份氯化钠）中，正常组除外。待兔耳变白变硬后再冻30 s，取出，空气中停留20 s后以35℃温水复温20s，取出兔耳，擦干水分，冻伤模型复制完毕。冻伤后48h开始在冻伤兔耳剪毛区域分别涂药，1 ml/次，3次/d，涂药4 d后，治疗结束。

　　2.2 冻耳治疗后外观评价 

　　冻耳皱缩变形的范围大小反映了组织细胞坏死和瘢痕修复的范围大小，是药物对冻伤所致组织细胞变性的保护和促恢复作用的直接体现。此处将冻耳治疗后外观评价由好到差分为4级：正常（冻耳治疗后颜色、外观、触感和厚度与正常兔耳完全一样）、轻度变形(冻耳耳尖至耳根方向2 cm区域内皱缩变形)、中度变形(耳尖至耳根方向4 cm区域内皱缩变形)、重度变形(耳尖至耳根方向皱缩变形范围超过4 cm)。

　　2.3 冻耳病理检查 

　　治疗4 d后，家兔左耳耳缘静脉空气栓塞致死，立即沿浸冻线剪下冻耳浸冻部分，由耳尖垂直于浸冻线方向将冻耳浸冻部分剪成对称的两半，一半以4%甲醛溶液固定（另一半留做SOD、MDA和TNF-α测定），分别在耳尖向耳根方向1，2，3 cm处取材，常规石蜡包埋，HE染色，以正常兔耳为对照，显微镜下观察冻耳组织病理变化。

　　2.4  SOD、MDA和TNFα测定

　　［8］涂药2 d后，左耳中央动脉取血约4 ml。涂药4 d后心脏取血约4 ml，取“2.3”项下病理检查剪下的另一半冻耳，剪取耳尖部，置事先盛有预冷生理盐水的小烧杯中，涮洗几下，取出，滤纸吸干水分，称1 g耳尖部组织，用10ml预冷pH7.4的0.01 mol/L的PBS制备组织匀浆。血液与组织匀浆4℃分别以4 000 r/min和2 000 r/min离心10 min，取血清和耳组织匀浆上清，按试剂盒中操作方法测定SOD总活力、MDA与TNF-α含量。

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