食品分析知识点整理(2)

法。适用于易氧化，含水分较多又有较多挥发形成分（醚类、芳香油、挥发酸、CO2等）的食品及香辛料等，用干燥法测定误差较大，适宜用蒸馏法。 (3) 操作方法

准确称取适量样品(估计含水量2~5ml)，放入水分测定测定仪器的烧瓶中，加入新蒸馏的甲苯(或二甲苯)50~75ml使样品浸没，连接冷凝管及接受管，从冷凝管顶端注入甲苯(或二甲苯)，使之充满水分接受刻度管。

加热慢慢蒸馏，使每秒钟约蒸馏出2滴馏出液，待大部分水分蒸馏出后，加速蒸馏使每秒约蒸出4滴馏出液，当水分全部蒸出后(接收管内的体积不再增加时)，从冷凝管顶端注入少许甲苯(或二甲苯)冲洗.如发现冷凝管壁或接受管上部附有水滴，可用附用小橡皮头的铜丝擦下，再蒸馏片刻直接接受管上部及冷凝管壁无水滴附着为止。读取接受管水层的容积。 (4)注意事项

①样品如为粉状或者半流体，须将样品瓶底铺满海砂增加样品分散性，溶剂和样品充分接触，然后加入共沸剂蒸馏。

②含糖分高的样品宜用油浴加热(控温精度高，受热均匀)。

③加热温度不宜太高，温度太高时冷凝管上端水汽难以全部回收。蒸馏时间一般为2~3小时，样品不同蒸馏时间各异。

④为了尽量避免接受管和冷凝管壁附着水滴，仪器必须洗涤干净。 ⑤优缺点。优点：热交换充分；受热后发生化学反应比干燥法少；设备简单，管理方便。 缺点：水与有机溶剂易发生乳化现象；样品中水分可能完全没有挥发出来，食品组织多羟基结构不利于有机溶剂浸入；水分有时附在冷凝管壁上，造成读数误差，对分层不理想，造成读数误差，可加少量戊醇或异丁醇防止出现乳浊液。

3. 卡尔?费休法（费休标准溶液是含有I2、SO2、C5H5N及CH3OH的混合溶液） (1) 原理

测定水分的容量法(滴定法)，属于碘量法，是测定微量水分最准确的化学方法。费休法的滴定总反应式：（I2+SO2+3C5H5N+CH3OH）+H2O 2 C5H5N ?HI+ C5H5N ?HSO4CH3。过量一滴卡尔费休中的游离碘即会使体系呈现淡黄色甚至棕黄色，即为终点。原理是利用I2氧化SO2时，需要有定量的水参与反应。

常用吡啶(C5H5N)作溶剂，目的:中和HI。加入甲醇使其生成硫酸甲酯吡啶

C5H5NHSO3OCH3，该物质稳定，不与水反应，可防止消耗水的副反应发生。K-F试剂：置于暗处24小时后标定使用。 (2) 适用范围

费休法广泛地应用于各种液体、固体及一些气体样品中水分含量的测定，均能得到满意的结果，在很多场合，此法也常被作为水分特别是痕量水分（低至ppm级）的标准分析方法，用以校正其他测定方法。是国际和国家标准测微量水分。

在食品分析中，采用适当的预防措施后此法能用于含水量从1ppm到接近100%的样品的测定，已应用于糖果、巧克力、油脂、乳糖和脱水果蔬类、面粉、砂糖、人造奶油、可可粉、糖蜜、茶叶、乳粉、炼乳及香料等食品中的水分测定，结果的准确度优于直接干燥法，也是测定脂肪和油品中痕量水分的理想方法。含Vc的不能用此法，Vc有还原性，被I2氧化，使I2有效浓度降低，从而使测定结果偏高。K-F不仅可测得样品中的自由水，而且可测出结合水，结果更客观地反映出样品中总水分含量。 (3) 操作方法

对于固体样品，如糖果必须事先粉碎均匀。最好用粉碎机而不用研磨，防止水分损失。取50 ml甲醇 → 于反应器中，所加甲醇要能淹没电极，用KF试剂滴定50 ml甲醇中痕量水（消除其中微量水份干扰）→ 滴至指针与标定时相当并且保持1min不变时 → 打开加料口 →

将称好的试样立即加入（防吸水） → 塞上皮塞 → 搅拌 → 用KF试剂滴至终点保持1min不变 → 记录。

4.微波干燥法：原理：用微波辐射加热样品，使水分高效、快速的蒸发，通过系统中

的精密天平对样品干燥前后失重的测定求出水分含量。适用范围：水分含量在12~100%的样品。

5.红外线干燥法：本法以红外线为加热干燥的热源。糖蜜水分测定，糖蜜易焦化，含糊分高、粘稠，有机溶剂与水溶性糖难互溶，难渗透到样品内部，在甲醇中溶解度小，对红外线吸收大。

（二）、水分活度值的测定

概念：食品周围环境空气干燥、湿度低→食品中水向外挥发→食品变干燥；食品周围环境湿度大→食品吸收水分→ 食品变湿润。水分活度是食品的水分蒸汽压P 与相同温度下纯水的蒸汽压Po 的比值Aw=P/Po ，也可以用相对平衡湿度表示Aw=ERH/100。即：

Aw=P/P0=ERH/100。 食品的平衡相对湿度：食品中的水分蒸汽压达到平衡后，食品周围的水蒸汽分压与同温度下水的饱和蒸汽压之比。食品的温度<0℃时， P为冰的蒸汽压，Po为过冷水蒸汽压，此时Aw与组成无关，只是食品温度的系数。食品的温度>0℃时，Aw是食品组成与食品温度的系数，主要是组成。T↑则Aw↑。Aw↓则水和食品结合程度↑，Aw↑结合程度↓。

常用方法：水分活度测定仪法（AW测定仪法）；溶剂萃取法；扩散法；冰点降低法。 ①水分活度测定仪：在一定温度下主要利用Aw测定仪中的传感器。在样品测定前需用氯化钡饱和溶液校正Aw测定仪的Aw为9.000。

②溶剂萃取法：食品中的水可用不混溶的溶剂苯来萃取。苯在一定温度下其萃取的水量随样品中水分活度而变化，即萃取的水量与水相中的水分活度成比例→一定温度下从食品中萃取的水量与同温度下测定的苯中饱和溶解水量比值即为该样品水分活度。测萃取的水量：加苯后振摇1小时使充分溶解水；测苯中饱和溶解水值：取蒸馏水代替样品，加苯振摇2分钟充分饱和。

③扩散法：样品在康威氏微量扩散皿密封和恒温下，分别在较高和较低的标准饱和溶液中扩散平衡后，根据样品重量增(Aw较高标准液)减(Aw较低标准液)的量，求出样品的Aw值。 二、蛋白质测定：掌握凯氏法、紫外法原理、方法种类，掌握半微量法碱性蒸馏装置、

使用；了解其他测定方法的原理等。

湿法消化、水蒸气蒸馏、酸碱滴定法。

凯氏法原理：消化、蒸馏、吸收、滴定。样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化;使蛋白质分解，其中C和H被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。 [滴定所用无机酸的量(mol) 相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量] 。

方法种类：凯氏常量定氮法、凯氏微量定氮法、自动定氮仪法。

消化：溶液中加入适当的无机盐K2SO4，可提高浓硫酸沸点，加快消化反应（蛋白质分解），并使消化完全。但硫酸钾加入量不能太大，易造成温度过高，生成的硫酸氢铵分解，放出氨而造成损失。加入CuSO4做催化剂，既可防止污染，又可以作消化完全的指示剂。消化过程通常也加入少量H2O2，KClO，作为强氧化剂，加速有机物的氧化。消化过程中应小火加热，保持和缓沸腾（以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失），至透明无黑粒时摇动瓶子，使瓶壁炭粒溶于硫酸中。样液呈透明绿色状态——二价铜离子的颜色。消化剂变绿色后继续消化30分钟即可。消化时，如不容易呈透明溶液，可将K氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2~3ml，促使氧化。

蒸馏：测定是以碱性、挥发性大的NH3为定量标准，在操作中注意加入NaOH溶液要过量，分解硫酸铵，保证NH3全部释放出；防止样液中NH3气逸出（注意密闭性，在蒸馏烧瓶加水水封）。向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀，碱与CuSO4反应生成Cu（OH）2，经加热后又分解生成CuO的沉淀。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，清洗管口再蒸1分钟后关掉热源，避免造成吸收液倒吸。氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸检查馏出液是否为碱性。

滴定终点:（盐酸标准溶液滴定硼酸，混合指示剂）蓝色→微红。

注意：要做空白实验，除不加样品外，从消化开始所有操作相同！所有试剂应用无氨蒸馏水配制。

凯氏定氮蒸馏装置

微量凯氏定氮法：①蒸馏前给水蒸汽发生器内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升以使其始终保持酸性，避免水中的氨被蒸出影响测定结果。②蒸馏时蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽， 否则将发生倒吸。③加碱要足量，操作要迅速，漏斗应采用水封措施，避免氨由此逸出损失。

自动凯氏定氮法：自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置、自动吸收和滴定装置及自动数字显示装置。消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外线加热装置组合而成的消化炉。试剂：硫酸铜与硫酸钾制成片剂。 快速测定方法 1、双缩脲法。

原理：在碱性条件下，Cu2+和多肽(至少有两个肽键，如双缩脲、多肽和所有蛋白质)生成的复合物呈紫红色，吸收波长为560nm，比色法测得的吸光度值(OD值)与样品中的蛋白含量成正比。以酪蛋白为标准样品，制作标准曲线，从而求出样品蛋白质含量。该法已被用于谷物、肉类、大豆及动物饲料的蛋白质定性测定。

? 说明及注意事项：①测定可溶性蛋白，速度快，但灵敏度低。②蛋白质种类不同对发色程度的影响不大。③含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去。④样品中有不溶性成分存在时，

给比色测定带来困难，可预先将蛋白质抽提出再进行测定。⑤当肽链中含有脯氨酸时，若有大量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。⑥用NaOH配酪蛋白标准溶液。⑦以酒石酸钾钠作稳定剂。⑧配置试剂加入硫酸铜溶液时，必须剧烈搅拌，否则将生成Cu（OH）2沉淀。⑨加入四氯化碳，以减少脂溶性成分干扰，而且消除乳化现象，避免上清液不清，难以比色测定。

2、紫外法：

280nm紫外吸收法原理：由于蛋白质中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此具有紫外吸收性质，在280nm处，蛋白质溶液的光吸收值与其浓度成正比，可定量测定。

肽键紫外吸收法原理：蛋白质溶液在238nm下均有光吸收，其吸收强弱与蛋白质中肽键多少成正比。根据这一性质，可测定样品在238nm下的光吸收值，与标准蛋白质溶液作对照，求出蛋白含量。本法比280nm吸收法灵敏。 3、福林-酚比色法

原理：蛋白质与福林-酚试剂反应，产生蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键产生双缩脲反应，同时蛋白中存在的酪氨酸与色氨酸同试剂中的磷钼酸-磷钨酸反应产生颜色。呈色强度与蛋白质含量呈正比，是检测可溶性蛋白含量的最灵敏的经典方法之一。

说明：此法灵敏度高，酚类及柠檬酸对本法有干扰。 ４、考马斯亮蓝染料比色法

原理：考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德华力结合，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮兰G250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染

料的最大吸收峰（Amax）的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

说明及适用范围：本法适用于牛乳、冰淇淋、巧克力饮料、脱脂乳粉等食品。本法快速、简单，适合大量样品测定，灵敏度与福林-酚法相近，但不受酚类、游离氨基酸和小分子肽的影响。

５、水杨酸比色法

原理：样品中的Protein经H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水杨酸钠及次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。

说明：样品消化后当天测定，重现性好。显色与温度有关，严格控制温度 ６、杜马斯法（燃烧法）

原理：样品在高温下（700-800℃）燃烧，释放的氮气用热导检测器（TCD）的气相色谱仪测定。测得的氮含量转换成样品中的蛋白质含量。

说明：本法适用于所有种类样品，AOAC方法分别用于肉类和谷物类食品。优点：是凯氏定氮法的替代方法；不需要任何有害化合物；可在3min内完成；适合样品批量分析。缺点：仪器价格昂贵；非蛋白质但也包括在内。 ７、近红外分析法（NIR） 氨基酸的测定

多种氨基酸同时共存于食品中→测总氨基酸量→不能以氨基酸百分率来表示，因为各氨基酸分子量大小不同，要以氨基酸中所含氮（氨基酸态氮）的百分率表示。 1、甲醛滴定法

原理：氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH，并用间接的方法测定氨基酸总量。

说明及注意事项：此法适用于测定食品中的游离氨基酸。40%中性甲醛溶液配置：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定。第一次用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点，此时并未滴定氨基酸中的羧基，而是中和样液中其它酸性物质。第二次用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定至淡蓝色为终点，是包括氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。 2、茚三酮法

原理：氨基酸在一定pH范围内，氨基能与茚三酮中的羰基缩合，生成兰紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应）。可以用吸光光度法于570nm下测定吸光值定量测定。

SnCl2·H2O是稳定剂（氯化亚锡具有还原性，防止茚三酮氧化）。醋酸：使氨基酸充分游离出来。活性炭：脱色素。水浴15分钟：保证缩合显色反应充分。氨基酸标液要称干燥氨基酸。磷酸缓冲液（pH.8.04）。茚三酮：用热水溶解，冷水洗涤结晶。 （四）、氨基酸的分离与测定：掌握甲醛滴定法、印三酮法，了解HPLC法原理；各种方的样品前处理方法。

１、薄层色谱法(TLC)

操作方法：制板→样品的制备→点样→层析→茚三酮显色→与标准氨基酸进行对比→鉴别各种氨基酸种类→从显色斑点颜色深浅确定其含量。

展开剂的选择方法：样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的体系。样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高的体系。 2、氨基酸自动分析仪

原理：利用氨基酸极性和分子量大小不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后，采用不同的pH值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来。洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。测定样品中各种游离氨基酸含量，可以除去脂肪等杂质后，直接上柱进行分析。测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解，使蛋白质完全变成氨基酸后才能上柱进行分析。

定量测定的依据是氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。不是所有氨基酸都如此，脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物，故需在另外波长处定量测定。

操作方法：

样品处理：如果样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质，必须将样品预先除去杂质后再进行酸水解处理。去除杂质的方法如下:

去糖和淀粉：把样品用淀粉酶水解（不溶→可溶）。然后用乙醇溶液洗涤，得蛋白质沉淀物。

去脂肪：先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机溶剂离心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物。

去核酸：将样品在10%氯化钠溶液中，85℃加热6小时（增大溶解度），然后用热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮干燥即可。

去无机盐：样品经水解后含有大量无机盐时须用阳离子交换树脂进行去盐处理。

酸水解：称取经干燥的蛋白质样品数mg，加入2m1 5.7mol/L盐酸，置于110?C烘箱内水解24小时，然后除去过量的盐酸，加缓冲溶液稀释到一定体积，摇匀。取一定量的水解样品上柱进行分析。 ３、气相色谱法

原理：将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色谱分析的衍生物—三氟乙酰丁酯。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐(TFAA)的酰化两个步骤。将酰化好的氨基酸衍生物进行气相色谱分析。

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