食品分析知识点整理(3)

４、液相色谱法

原理：蛋白质样品经酸或碱水解后再用丹磺酰氯(强荧光剂)进行衍生化作用而溶解于流动相溶液中，采用高压液相色谱仪分离并用荧光检测器进行测定，即可测定出各种氨基酸的含量。

三、脂类测定：提取剂种类、优缺点；索氏提取法与酸水解法的原理方法注意事项；乳脂肪

测定的种类；食用油特性的定义。

（一）、提取剂与样品处理

1、提取剂：可采用低沸点的有机溶剂萃取脂类。 (1) 乙醚(非极性)。

优点：乙醚的沸点低为34.6℃，溶剂脂肪能力强大于石油醚。

缺点：能被2%的水饱和；含水的乙醚抽提能力降低(羟基与水能形成氢键使穿透组织能力降低，即抽提能力下降)；含水的乙醚使非脂成分溶解，而被抽提出来，使结果偏高（糖蛋白质等）；使结果偏高，而且乙醚易燃，安全性低。 (2) 石油醚

石油醚溶解脂肪能力比乙醚弱些，但吸收水分比乙醚少。没有乙醚易燃。使用时允许样品含有微量水分，它没有胶溶现象，不会夹带胶溶淀粉、蛋白质等物质。采用石油醚提取剂，测定值比较接近真实值。

对于乙醚、石油醚这两种溶剂适用于已烘干磨碎样品，不易潮解结块的样品 只能提取样品种中游离态的脂肪，不能提取结合态的脂肪； 对于结合态脂，必须预先用酸或碱破坏脂类和非脂成分的结合后才能提取。有时利用两种溶剂的优点，常常混合使用。

(3) 氯仿-甲醇是另一种有效的溶剂，它对于脂蛋白，磷脂的提取效率较高，特别适用于水产品、家禽、蛋制品等食品脂肪提取。 2、样品处理：

①粉碎：增加接触面，更有利于脂肪提取；

②加海砂：有的样品易结块，用乙醚提取较困难，为了使样品保持散粒状可以加一些海砂，一般加样品的4-6倍量(目的使样品疏松，这样扩大了与有机溶剂的接触面积，有利于萃取)；

③加入无水硫酸钠：因为乙醚可被2%水饱和，使乙醚渗入到组织内部抽提脂肪的能力降低，所以有些样品含水量高时可加入无水硫酸钠，用量以样品呈散粒状为止。

④干燥：干燥的目的：提高脂肪的提取效率。干燥时要注意温度，温度过高脂肪氧化；脂肪与糖、蛋白结合变成复合脂。

⑤水洗：对有些样品还有大量的碳水化合物，测定脂肪时应先用水洗掉水溶性碳水化合物再进行干燥、提取。

⑥酸处理：温度过高时脂与糖、蛋白质等接触，变成复合脂，产生复合脂后，不能用溶剂直接抽提，所以要用酸处理，目的是把结合脂肪水解出。 （二）、脂类测定 1. 索氏提取法

(1) 原理：将经过预处理得到的松散且干燥的样品用无水乙醚或其它机溶剂，在索氏提取器(利用什么原理？)中回流提取，使样品中的脂肪溶入有机溶剂中，确定回收溶剂后残留物质的质量，即为样品中粗脂肪的含量。

(2) 适用范围：适用于游离脂含量高，结合态脂类含量低的样品； (3) 注意：

①剩1-2mL时在水浴上蒸干，避免减压回收时，压力较低，造成部分脂肪的损失 ②整个体系须充分干燥，否则无水乙醚吸收2%水分后会抽提出非脂成分；

③抽提时冷凝管上端最好连接一个氯化钙干燥管，这样可防止空气中水分进入； ④乙醚中不得含过氧化物，否则会导致部分脂肪的氧化，烘干时也容易爆炸，检测方法：取6mL乙醚，加入2mL 100g/L的碘化钾溶液,振摇1min后,不出现黄色为合格)；

⑤蒸馏乙醚，切忌用明火加热；留个缝别关紧。

⑥干燥残留物时不要将烘箱门关紧，以避免因乙醚浓度过高引起爆炸。 2. 酸水解法

原理：将样品与盐酸溶液一同加热进行分解，使结合态或者包藏在组织中的脂肪游离出来，再用乙醚和石油醚提取，经回收溶剂，得到干燥提取物即为样品中的脂肪。测出的脂肪为游离态脂和结合脂全部脂类。

适用范围：本法适用于各种形态脂肪的测定；但是不适用于鱼类、贝类等样品，因为含磷脂多，磷脂在盐酸介质中容易分解。不适用含糖分高的样品，因为糖份遇到酸容易碳化

注意：

①实验过程中，水解后一般要加入适量乙醇，其目的是沉淀蛋白质，促进脂肪聚集；除去部分碳水化合物、有机酸等，使其保留到水相。

②加入石油醚目的是：降低乙醇和水分在乙醚中的溶解度，使乙醇溶解物留在水层，使分离效果更好，分层更明显。石油醚不能被水饱和，不能形成胶溶，使分层明显。

③水解时最好加上回流装置，避免水分损失，使酸度升高，酸度高，加热条件下可能造成脂中的酯键水解为脂肪酸。

④挥干后如呈黑色焦油状，主要是分解物与水混合所致，如何处理？用等量的乙醚和石油醚混合溶剂重新溶解，最好溶解后加入无水硫酸钠（去除水分，免石油醚效率低）干燥，过滤，然后再进行挥干。

3. （乳脂）罗兹——哥特里法

原理：碱性乙醚提取法、重量法测定乳脂肪，用氨-乙醇溶液破坏乳的胶体性状和脂肪球膜，暴露出脂肪球，再利用乙醚-石油醚提取脂肪，干燥，称量，即得脂肪含量。

适用范围：本法适用于各种液状乳(生乳、加工乳、部分脱脂乳、脱脂乳等)，各种炼乳、奶粉、奶油及冰淇淋等能在碱性溶液中溶解的乳制品，也适用于豆乳或加水呈乳状的食品。本法为国际标准化组织(ISO)， (FAO／WHO)等采用，为乳及乳制品脂类定量的国际标准法。

注意：

①为什么氨-乙醇溶液可以破坏乳的胶体性状和脂肪球膜？因为一来改变溶液体系的电荷性质，阻止胶体形成；二来酪蛋白酸钙盐成为可溶性的酪蛋白酸铵。

②操作时加入乙醇的作用是沉淀蛋白质以防止乳化，并溶解醇溶性物质，使其留在水中，避免进入醚层，影响结果。

③加入石油醚的作用是降低乙醚极性，使乙醚与水不混溶，只抽提出脂肪，并可使分层清晰。

4. （乳脂）巴布科克法和盖勃法

原理：用浓硫酸溶解乳中的乳糖和蛋白质等非脂成分，将牛奶中的酪蛋白钙盐转变成可溶性的重硫酸酪蛋白，使脂肪球膜被破坏，脂肪游离出来，再利用加热离心，使脂肪完全迅速分离，直接读取脂肪层的数值，便可知被测乳的含脂率。

适应范围与待点：适用于鲜乳及乳制品脂肪的测定。对含糖多的乳品(如甜炼乳、加糖乳粉等)，采用此方法时糖易焦化（有浓硫酸），使结果误差较大，故不适宜。

? 此法操作简便，迅速。对大多数样品来说测定精度可满足要求，但不如重量法准确。

5. 食用油脂理化特性测定[掌握概念]

? 酸价：中和1 g 油脂中的游离脂肪酸所需氢氧化钾的质量（mg)。酸价是反映油脂酸败的主要指标。

? 碘价（碘值）：100 g 油脂所吸收的氯化碘或溴化碘换算成碘的质量（g)。碘价在一定范围内反映油脂的不饱和程度。

? 过氧化值：滴定1 g 油脂所需用( 0.002 mol/L ) Na2S2O3 标准溶液的体积（mL)。过氧化值大小是反映油脂是否新鲜及酸败的程度。

? 皂化价：中和1 g 油脂中的全部脂肪酸（游离+ 结合的）所需氢氧化钾的质量（mg)。皂化价可对油脂的种类和纯度进行鉴定。

? 羰基价：用羰基价来评价油脂中氧化物的含量和酸败程度。酸败后会产生醛、酮等羰基。总羰基价——用硫代巴比妥酸比色法测定。 ? 氧化值：酸败成分氧化时所需氧的毫克数。

四、糖类测定：掌握还原糖、蔗糖、淀粉、纤维素测定方法，了解果胶测定；重点掌握还原

糖几种测定方法的原理及实验现象、注意问题，尤其直接滴定法。

可溶性糖样品预处理：食品中可溶性糖通常指葡萄糖、果糖等单糖以及蔗糖等低聚糖。测定可溶性糖时一般要选择适当的溶剂进行提取，然后对提取液进行纯化，排除干扰，然后才能测定。提取→澄清(纯化)。

提取剂：①水——温度一般控制在40-50oC，效果较好。温度高时，有可溶性淀粉和糊精溶出干扰测定。如果样品中含酸性物质较多，为避免加热提取时蔗糖等低聚糖部分水解，提取液应事先调为中性。另外，提取过程如用水提取，还要加入HgCl2使酶失活，防低聚糖被酶水解。②乙醇水溶液——对糖类有一定溶解性，但乙醇浓度足够高时，可避免蛋白质、糊精和淀粉溶出。通常用的是70-85%的乙醇溶液。用该提取剂的优点在于不用对提取液进行除蛋白质的预处理操作。

提取液的制备原则：①确定合适的取样量和稀释倍数。②含脂肪的食品须经脱脂后进行提取：样品中含脂肪较高时，应用石油醚进行脱脂萃取数次，每次处理后倾去石油醚层，然后用水提取糖类。③含大量淀粉、糊精的样品，需采用乙醇溶液提取④含酒精和二氧化碳的液体样品：需加热除去挥发组分，并用氢氧化钠溶液调节溶液至中性，以免造成部分低聚糖的酸性水解及单糖的聚合副反应。

提取液的澄清（沉淀干扰物）：

①中性乙酸铅[Pb(CH3COO)2?3H2O] 铅离子能与很多离子结合，生成难溶沉淀，同时吸附除去部分杂质。它可以除去蛋白质、果胶、有机酸、单宁等杂质。其作用可靠，不沉淀溶液中的还原糖，室温下也不会形成铅糖化合物。因而适用于还原糖样液的澄清。缺点：脱色能力差，不适用于深色样液。主要适用范围：浅色糖及糖浆制品、果蔬制品、焙烤制品等。注意事项：铅盐有毒，使用时注意操作规范，注意防护。

②乙酸锌-亚铁氰化钾溶液

利用乙酸锌[Zn(CH3COO)2?2H2O]与亚铁氰化钾反应生成的氰亚铁酸锌沉淀来带走或吸附干扰物。优点：除蛋白质能力强。缺点：脱色能力差。主要适用范围：适用于浅色、蛋白质含量较高的乳制品、豆制品等样液。

③硫酸铜-氢氧化钠溶液

主要适用范围：在碱性条件下，沉淀蛋白，适合富含蛋白质的样品溶液澄清。 ④碱性乙酸铅

适用范围：适用于处理深色糖液，能除去蛋白质、有机酸、单宁等杂质，又能凝聚胶体。缺点：生成较大沉淀，易带走糖，特别是果糖。另外过量的碱性乙酸铅易改变糖类旋光度。

⑤氢氧化铝溶液(铝乳)

主要应用：能凝聚胶体，可用于浅色糖液澄清或者作为附加澄清剂使用；缺点：对非胶态杂质澄清效果不好。

⑥活性碳

主要应用：适用于深色提取液，主要用于除色素；缺点：易吸附较多糖类造成损失，特别对于蔗糖损失可达6-8%，因而其应用较少。 1.（还原糖）直接滴定法：

(1) 除铅的必要性：澄清后的样液中残留有铅离子，在后边测定过程加热样液时，铅能与还原糖（特别是果糖）结合生成铅糖化合物，使消耗的还原糖量增加，从而使测定结果偏低。 (2) 计量原理：本法是根据一定的碱性酒石酸铜溶液(Cu2+量一定)消耗量来计算样液中还原糖含量，反应体系中Cu2+的含量是定量的基础。

(3) 操作方法：一定量碱性酒石酸铜甲（硫酸铜+次甲基蓝）、乙液（NaOH+酒石酸钾钠+亚铁氰化钾）等量混合→立即生成天蓝色Cu(OH)2沉淀→沉淀很快消失，成透明深蓝色(Cu(OH)2与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色可溶性酒石酸钾钠铜络合物)→加热→以次甲基蓝为指示剂→含还原糖的样液滴定→样液中还原糖与酒石酸钾钠铜反应→生成红色的Cu2O沉淀。Cu2+全部被还原后→稍过量的还原糖把次甲基蓝还原→溶液由蓝色变为无色→即为滴定终点。据样液消耗量可计算出还原糖含量。

(4) 优点：试剂用量少，操作比较简便、快速，滴定终点明显。适用于各类食品中还原糖的测定。缺点：测定酱油、深色果汁等样品时，因色素干扰，滴定终点常常模糊不清，影响准确性。本法是GB方法。 (5) 注意事项

①实验过程中有两次添加亚铁氰化钾：（1）配置碱性酒石酸铜标准溶液加入；（2）样品溶液前处理时加入。它们的作用有何不同??

碱性酒石酸铜乙液中加入亚铁氰化钾是为了使亚铁氰化钾与Cu+生成可溶性的无色络合物，而不再析出红色沉淀(Cu2O)，滴定时防止红色Cu2O沉淀干扰终点判断；

样品溶液前处理时加入是为了和醋酸锌反应形成白色沉淀，作为澄清剂，吸附除去溶液中的蛋白质等杂质，避免干扰测定。

②测的是总还原糖量：此法所用的氧化剂碱性酒石酸铜的氧化能力较强，醛糖和酮糖都可被氧化，所以测得的是总还原糖量。

③配制时需加入一定量的亚铁氰化钾， ④终点指示:次甲基蓝也是一种氧化剂，但在测定条件下氧化能力比Cu 2 +弱，故还原糖先与Cu 2 + 反应， Cu 2 +完全反应后，稍过量的还原糖才与次甲基蓝指示剂反应，使之由蓝色变为无色/淡黄色，指示到达终点。

⑥碱性酒石酸铜甲液和乙液使用:应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出Cu2O沉淀，使试剂有效浓度降低。

⑦滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，而且滴定必须在沸腾条件下进行。一是可以加快还原糖与Cu2+的反应速度；二是次甲基蓝变色反应是可逆的，还原型次甲基蓝遇空气中氧时又会被氧化为氧化型，造成滴定终点不稳！三是氧化亚铜也极不稳定，易被空气中氧所氧化。四是保持操作稳定和反应液沸腾可防止空气进入，避免次甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加耗糖量。

⑧要在几分钟之内快速沸腾且完成滴定实验，一是减少与空气接触的机会。二是使体系不至于水分过度会发而明显改变浓度，造成反应环境发生较大变化，从而影响还原糖对二价铜离子的还原能力不稳定，导致测定结果不准。

⑩影响测定结果的主要操作因素:反应液碱度、热源强度、煮沸时间和滴定速度

2.（还原糖）高锰酸钾滴定法

(1) 原理：一定量的样品溶液与一定量过量的碱性酒石酸铜溶液反应→还原糖将二价铜还原为氧化亚铜→过滤得氧化亚铜沉淀→加过量酸性硫酸铁溶液，将其氧化溶解→Fe3+被定量还原为Fe2+ (还原性)→用高锰酸钾标准溶液氧化滴定所生成的Fe2+→根据高锰酸钾溶液消耗量可计算出氧化亚铜量→再从检索表中查出与氧化亚铜量相当的还原糖量→即可计算出样品中还原糖含量。

(2) 本法为国家标准分析方法之一，适用于各类食品中还原糖的测定。优点:准确度高，重现性好，准确度和重现性都优于直接滴定法。有色样品溶液不受限制，因为生成的氧化亚铜沉淀被过滤出来，与原体系分离开来。缺点：操作复杂、费时，需使用特制高锰酸钾法糖类检索表

(3) 与直接滴定法最大的区别在什么地方？因操作原理区别，不加亚甲基蓝，不加亚铁氰化钾，用过量酒石酸铜溶液，直接滴定法用量为定量（样液滴定碱性酒石酸铜溶液，根据酒石酸铜溶液浓度含量定量还原糖)。不加亚铁氰化钾：亚铁氰化钾和氧化亚铜沉淀反应，形成稳定的可溶性络合物盐，而本方法是以氧化亚铜沉淀为定量标准(需要过滤出来再进行定量)，因此不能加亚铁氰化钾。用过量酒石酸铜溶液：保证把所有还原糖全部氧化，生成与其含量对应的定量氧化亚铜； (4) 说明

①初步监测样液含糖浓度是否合适。合适：煮沸后反应液应呈蓝色(过剩Cu2+存在, 即酒石酸钾钠铜络离子)。不合适：不呈蓝色，说明碱性酒石酸铜溶液量不够，反映了样液含糖浓度过高，应调整样液浓度。

②样品预处理时，加入碱性酒石酸铜甲液和氢氧化钠溶液，因为碱性酒石酸铜甲溶液:CuSO4+H2SO4+H2O，它与NaOH反应生成Cu(OH)2↓，作为澄清剂，吸附除去蛋白，胶状物质等杂质，避免干扰测定。

③在样品测定时，把样品溶液与碱性酒石酸铜溶液一起沸腾时，须在反应器上加盖表面皿，一是防止沸腾反应过程中溶液飞溅出来损失；二是防止空气对流，使空气中的氧进入体系，氧化生成的氧化亚铜沉淀，造成氧化亚铜损失，导致结果偏低。

④本方法样品预处理时，不能用乙酸锌-亚铁氰化钾体系作为澄清剂。因为此法以测定反应过程中产生的定量的Fe2+为计算依据，因此，在样品处理时，不能用乙酸锌和亚铁氰化钾作为澄清剂，以免引入Fe2+，使得测定结果偏高。

⑤过滤及洗涤Cu2O沉淀的整个过程中需要注意：应使沉淀始终在液面以下，避免氧化亚铜暴露于空气中而被氧化。 3.（还原糖）碘量法

(1) 原理：样品经处理后，取一定量样液于碘量瓶中，加入一定量过量的碘液和过量的氢氧化钠溶液，样液中的醛糖在碱性条件下被碘氧化为醛糖酸钠 →反应液中碘和氢氧化钠都是过量的，两者作用生成次碘酸钠残留在反应液中，当加入盐酸使反应液呈酸性时，析出碘 →然后，用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘，则可计算出氧化醛糖消耗的碘量，从而计算出样液中醛糖的含量。

(2) 特点：本法用于醛糖和酮糖共存时单独测定醛糖。适用于各类食品，如硬糖、果汁等样品中葡萄糖的测定。

(3) 注意:本方法的样品用丙酮溶液提取不合适。因为丙酮会消耗单质碘(碘仿反应)，影响测定，故应除去。

4.（还原糖）二硝基水杨酸法（DNS法）

(1) 原理: 氢氧化钠和丙三醇存在下，还原糖能将3,5-二硝基水杨酸中的硝基还原为氨基，生成氨基化合物。此化合物在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈橘红色，在540nm波长处有最大

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