国家基金标书写作全攻略(4)

5.2 本项目的顺利实施将对我国参与国际猪基因知识产权争夺具有重要意义。

基因及DNA标记具有重要的的商业价值，基因的专利被文明加以保护，这意味着基因具有很大的经济利益（陈越等，2000年）。随着国际人类和动物基因组研究计划研究的深入发展，已逐步演变为一场基因知识产权的争夺战。因此有必要分离鉴定新基因的研究进度。本申请项目利用GenBank数据库的现存信息，从EST即cDNA部分序列入手，通过同源筛选，直接搜寻新基因不失为一种在“基因抢夺战”中获胜的捷径（田芳等，2000），将对我国参与国际猪基因知识产权争夺具有重要意义。

5.3 利用猪参考家系分析新基因与经济性状的关联，将为我国开展标记辅助选择进行猪的遗传改良起积极作用。

5.4 本项目将丰富猪12号染色体的遗传与物理图谱，加深对猪基因组结构的认识。 5.5 本项目研究将可能加深对猪12号染色体起源进化的认识。 5.6 本项目是本室前国家自然科学基金的进一步深入。

本室在前国家自然科学基金项目资助下，已围绕猪12号染色体上基因从细胞和分子水平已做了大量较系统的研究工作，在猪12号染色体研究中已经形成了一定的特色和优势，因此本项目的申请是建立在前国家自然科学基金研究所奠定的理论和技术基础及研究成果基础上（详见工作基础部分），是前国家自然科学基金的进一步深入。 因此，本项目的研究具有重要的科学与实践意义。

7. 主要参考文献

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三、研究方案

1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 1.1. 研究目标

1.1.1 从选定的20个候选基因中，完成猪12号染色体上5—7个新的功能基因的全长cDNA（或近全长cDNA）的分离和鉴定。 1.1.2 分析上述cDNA的结构特征。

1.1.3 利用参考家系分析上述新基因的遗传规律及与经济性状的关联。

1.2 研究内容

1.2.1 选取位于人17号染色体上和小鼠11号染色体上的20个候选基因（候选基因的名称和选取办法见2.1.1 ），以上述候选基因的编码区的保守序列作为信息探针，用美国国家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）提供的BLASTN 和BLASTP 对GenBank的猪EST数据库进行电子信息杂交筛选，获得高度同源的猪ESTs，构建EST重叠群，根据EST重叠群信息设计引物，结合RT-PCR和阻抑性RACE（阻抑性cDNA 末端快速扩增，Suppression rapid amplification of cDNA ends）方法获取上述候选基因的同源基因全长cDNA（或近全长cDNA）。

1.2.2 通过DNA序列测定、同源性比较、结构特征分析及遗传与物理定位等方式进行鉴定和确证。

1.2.3 利用猪参考家系的性状测定资料，分析新分离基因与经济性状的可能关联。

1.3 拟解决的关键问题

1.3.1 利用电子信息杂交筛选方法，分离、鉴定和定位猪12号染色体上5—7个新功能基因和功能基因主要片段，试图在国内建立一种快速获取猪功能基因的新方法。

1.3.2 通过分析上述新分离的猪功能基因的结构特征、遗传规律和与经济性状的关联，旨在为MAS和MAI育种新技术寻找新的分子标记。 1.3.3 本研究的技术关键及解决办法详见

2. 拟采取的研究方法,技术路线,实验方案及可行性分析

2．1 研究方法、技术路线和实验方案

2.1.1 猪12号染色体新功能基因cDNA的分离和鉴定

(1) 电子信息杂交筛选。从GenBank数据库中选取位于人17号染色体上和小鼠11号染色体上的20个候选基因，分别是：PSMD12 (proteasome (prosome , macropain ) 26S subunit, 12 ; 蛋白酶体26S亚单位12)， EEF1D ( eukaryotic translation elongation factor 2 delta （guanine nucleotide exchange protein）; 真核翻译延长因子2γ (鸟嘌呤核苷酸交换因子))， RGS9 ( regulator of G-protein signaling 9 ; G蛋白信号9调节物)，PSMC5 ( proteasome (prosome , macropain ) 26S subunit, 5 ; 蛋白酶体26S亚单位5)，MAPT ( microtubule-associated protein tau ; 微管相关蛋白τ)，SDF1 ( stromal cell-derived factor 1 ; 基质细胞衍生因子1)， ACRP ( sperm acrosomal protein ; 精子顶体蛋白)， GTPBIP ( GTP-binding protein ; GTP结合蛋白)，HSS ( sperm protein ; 精子蛋白)，GNGT2 ( G-protein gamma subunit ; G蛋白γ亚单位)，ICAM2 ( intercellular adhesion

molecule 2 ; 细胞间粘着分子2 )，APOH ( apolipoprotein H ; 载脂蛋白H)，BECN1 ( beclin 1 (coiled-coil , myosin-like BCL2-interacting protein ) ; 绕线式肌球蛋白样互作蛋白)，MEOX1 ( mesenchyme homeo box 1 ; 间质同源框1)，NMT1 ( N-myristoyltransferase 1 ; N-十四酰基转移酶1)，ASPA (aspartoacylase ; 天冬氨酰基转移酶 )，P2X5 ( ATP receptor subunit ; ATP受体亚单位)，CTNS ( cystinosis , nephropathic ; 胱氨酸病基因 )，ENO3 (enolase ; 稀醇化酶)，PMP22 ( peripheral myelin protein 22 ; 外周髓鞘蛋白22)。

用Clustalw软件对多个物种（如人、小鼠、大鼠及牛等）中上述候选基因编码序列进行同源分析，选取高度保守的的编码序列作为信息探针，将其输入美国国家生物信息中心（NCBI）的局部同源比较服务器筛选猪EST数据库进行BLASTN分析(Alstchul 等，1997)，筛选出长度≥100bp，同源度在75%—95%的EST作为候选序列，送入GenBank核酸数据库检索，排除已克隆基因的ESTs后，利用GCG中ASSEMBLY程序将余下ESTs序列进行整和拼接，获得统计上一致的序列，构建EST重叠群。 (2) 候选基因cDNA的分离。

1)总mRNA提取及总 cDNA池（ cDNA pool） 的合成。根据所选取的上述候选基因在人和小鼠不同组织的表达信息，取猪的骨骼肌、脑、肺、睾丸、脾、肝等组织，用TRIzol (Life Technologies, GIBCO BRL) 总RNA抽提试剂盒从上述组织中抽提总RNA（具体方法参见我室杨澜等论文），进而提取总mRNA并合并成总 cDNA池。应用MarathonTM cDNA Amplification Kit (CLONTECH Inc, 美国) 在cDNA 两端平端连接含有多个限制性内切酶位点、自身互补的黏性末端接头，试剂盒配有公用的接头引物（adaptor primer, AP）（方法参照文献Altschul等，任宏伟等）。

2）阻抑性RACE方法。以同源性高的保守序列为依据设计引物对目的基因进行搜寻，具体方法是针对所构建的EST重叠群整合序列，进行计算机同源性比较，选取同源性最高的一段序列，综合考虑引物设计的几项原则，用PRIMER5.0软件设计基因特异性引物（gene specific primer, GSP1），与接头引物AP1一起经PCR扩增出相应的cDNA并纯化克隆测序。再根据测序结果，设计出相反方向的基因特异性引物GSP2，进一步获得全长的目的cDNA。PCR反应条件：94℃预变性3 min，然后94℃ 1 min ，55 min～ 60℃ 1 min ，72℃ 2 min，共35个循环，后接72℃ 延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。经克隆测序后，用GCG软件Assemble进行拼接。

3）完整可读框的证实。在所拼接的含完整可读框的cDNA 序列5’ UTR和3’UTR设计一对引物，在猪cDNA文库中扩增，以证实可读框。 2.1.2 计算机软件分析

将所获得的cDNA序列通过NCBI检索查新，并在GenBank注册。并用PC-GENE(IntelliGenetics Inc. Switzerland) 等软件对新基因cDNA的核苷酸序列进行结构分析，推导出编码氨基酸序列。用Clustalw 等软件将推导的氨基酸序列与同源基因编码的氨基酸序列进行同源性比较， 找出该序列中存在的保守结构域。 2.1.3 新基因的遗传规律研究

利用本室已建立的猪参考家系进行新分离基因的遗传规律研究。本室与国营常熟畜禽良种场合作建立的参考家系简介如下：初始群体由一头德国大约克公猪与配三头二花脸母猪，从F1中选出11头母猪，与其父亲连续回交1—3胎，回交后代共332头。三代个体血样已全部采集，DNA已全部提取储存。

利用PCR-SSCP方法分析新基因的遗传规律，该方法本室已建立（刘佳建，1996，华中农业大学硕士学位论文；周萍雷，1996，华中农业大学硕士学位论文；朱猛进，2000，扬州大学硕士学位论文）。

2.1.4 新分离基因的遗传连锁与染色体物理定位

采用辐射杂种细胞株定位系统（Radiation hybrid mapping panel, RH mapping）进行新基因的染色体物理定位。本室已拥有一套猪/仓鼠体细胞辐射杂种板 (INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel,IMpRH)，是由法国（Laboratoire de Genetique Cellulaire,INRA,Castanet-Tolosan,France） Martin Yerle 博士惠赠。且已经用于微卫星的染色体定位分析，方法已经建立。

遗传连锁定位拟通过本室建立的参考家系进行。目前本室通过霍英东青年教师基金，国家自然科学基金项目的研究，已基本建立起了基于本室参考家系材料的12号染色体的遗传图，并且使标记尽量分布均匀。本研究中遗传定位工作拟采用的计算机程序为CRIMAP。 2.1.5 新分离基因与经济性状的关联分析

利用最大似然法结合CRIMAP程序分析各种基因型与各经济性状的关联，本研究拟分析的经济性状主要有：初生重、初生至35（或45）曰龄平均曰增重、初生至90Kg平均曰增重、达90Kg时活体背膘厚、胴体长、眼肌面积、背腰部的皮脂重与肉骨重、腿臀部的皮脂重与肉骨重等。上述数据已全部收集。

2.1.6 研究方法的主要参考文献

1. 任宏伟，俞梅敏，茹炳根等， 白鲫鱼金属硫蛋白全长cDNA：MT-A，MT-B的克隆及其基因分型，科学通报，2000，45（14）：1520-1525。

2. 杨澜，赵书红，潘佩文，刘榜，李奎，从银染PAGE凝胶上回收mRNA差异显示的DNA片段的方法研究，中国动物遗传育种研究进展，中国农业出版社，1999, 171-172。

3. Altschul S F, Madden T L, Schaffer A A, et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 1997, 25(17):3389-3402.

4. Chenchik, A , Diachenko, L, Moqadam, F , et al. Full-length cDNA cloning and determination of mRNA 5’ and 3’ ends by amplification of adaptor-ligated cDNA. Biotechniques, 1996, 21(3):526-534.

5. Mao, M, Fu, G, Wu, J S , et al. Identification of gene expressed in human CD34(+) hematopoietic stem/progenitor cells by expressed sequence tags and efficient

2．2 本项目中技术关键与可行性分析

2.2.1 利用电子信息杂交筛选策略分离猪新基因，需要猪EST数据库中有充足的的信息量，据2001年1月21曰从GenBank猪EST数据库查询结果显示已收录57,060条 EST信息（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST）。在人类基因组研究计划推动下，目前国内外许多猪基因组实验室（包括本室）正在加大力度分离猪EST，已经获得了大量的猪ESTs即将提交GenBank猪EST数据库 （Tuggle等，2000年）。因此GenBank猪EST数据库的信息资源将能够满足本研究的需要。

2.2.2 阻抑性RAEC获取全长cDNA是本研究的技术关键，该方法也是近期国内外基因组研究中克隆cDNA的方法之一，有许多相关报道和成熟经验可以借鉴。另外申请者在完成国家自然科学基金项目的研究工作中，已熟练掌握了PCR引物设计、克隆测序及文库构建的相关技术，并且曾试验利用RACE方法克隆基因，已了解该方法的理论原理，掌握了该实验技术，因此该方法也是可行的。

2.2.3 新分离的基因是cDNA序列，而新基因的遗传连锁和染色体物理定位及遗传规律研究基

full-length

cDNA

cloning,

Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U.S.A.

1998,95(14):8175-8180.

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