dld006-蛋白定量(BCA法)-最强实验protocol

A dld’s Laboratory Manual ? All Rights Reserved 02.计算出标准曲线方程待用；

本次实验结果如上图所示

如R2值＞0.99，则本次实验可信；如R2值＜0.99，则根据情况，剔除不可信值或重复实验； 标准曲线方程的制作

① 选定数据后，“插入”菜单栏里选择“散点图”，再选择仅带数据标记的散点图；

② 选定上图中的“数据点”后，右键选择“添加趋势线”；在弹出来的菜单栏中选择“线性”，同时下方的“显示公式”和“显示R平方值”两个

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选项框也一并勾选；

03.计算出样本的OD平均值，结合标准曲线分析评估；

① 计算样本OD均值之前，要对相关孔的OD值进行初筛，如出现数值明显异常的，需提前排除；

② 样本OD值一般无特殊情况，数值不会相差悬殊；OD值需在标准曲线的区间之间，即不得低于最低值（样本蛋白质浓度太低），高于最高值（样本蛋白质浓度太高，稀释不够）；

③ 如进行了双梯度稀释，选择的标准在于，何者更接近标准曲线的中间段；

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04.确定使用某一稀释梯度的数值后，根据标准曲线方程，得出各样

品的蛋白浓度；

本实验采纳稀释10倍（2μL样品）的数值；

05.确定基准（最小值）浓度，根据样品体积酌情预留损耗，计算基

准样品蛋白总量；

① 配平的原则：只能选取浓度最低的样本作为基准进行配制，因浓度高可以吸取较少体积再加上蛋白裂解液或PBS补齐，而浓度低者则无法“无中生有”；

② 一般而言，各待配平蛋白总量的蛋白样品体积均相差不大，可根据所加裂解液体积，再考虑收集蛋白过程中的损耗，取整数即可；以本次实验为例，每个样本共计使用了400μL裂解液，基准体积确立为320μL。如果不清楚体积，可用移液枪估测。

06.根据基准蛋白总量，计算“定量体积”，即同样的蛋白总量下对应

的每一样品应吸取的体积；

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07.用基准体积减去每一样品应吸取的体积，即为补充的PBS（蛋白

裂解液）体积；

① 补齐体积的目的是为了使得每个样品的蛋白浓度一致；因每个定量后的样品，蛋白总量一致，体积一致，是故蛋白浓度也一致；

② 如出现负数，则说明计算基准（最低）蛋白总量时，未选择最低浓度，应重新选择基准浓度，再次计算；

08.优化数字后（只取整数部分）；

选中数字区域，右键选择“设置单元格格式”菜单，选择“数字”标题栏，选择“数值”，将“小数位数”设置为0；

09.抄录数字（需严格对应样品顺序），配齐各样品；

10.如用于WB，则对应体积的5×WB Loading Buffer，打匀后于97℃

煮沸；

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蛋白定量

Protein Quantitation

【蛋白定量的背景知识】 “蛋白定量”即蛋白质定量，蛋白质定量根据其目的分为全蛋白质的“总定量法”和特定蛋白质的“个别定量法”。

蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分。 ① 为验证细胞裂解是否成功；

② 或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存，需对细胞裂解液进行蛋白定量；

③ 为了判定蛋白的产量，需对纯化好的蛋白进行定量；

④ 为了将纯化好的蛋白用生物素或者报告酶进行标记，同样需首先对蛋白样品进行定量，以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。 蛋白定量分析涉及到生产科研的多个领域及行业，也是生物学科、食品检验及打击掺假掺伪、临床检验、诊断疾病和质量检验中最常见的方法。

【蛋白定量的方法】 蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科常涉及的分析内容。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是一项经常进行的非常重要的工作。蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的因难。 现测定蛋白质含量方法有很多： ① 根据物理性质：紫外分光光度法；

② 根据化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、BCA法、胶体金法；

③ 根据染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法； ④ 根据其他性质：荧光法；

蛋白定量的测试方法有很多种，其中较为常见的有五种，分别是Bradford法、Bradford斑点试验、Coomassie 斑点试验、紫外分光度检测法及BCA法这五种。当然，每种方法适用的情况都有所不同。

实验最常用的蛋白定量方法为BCA法和Bradford法（也就是考马斯染色法）。

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BCA蛋白定量和 Bradford法蛋白定量的区别 （1）Bradford法测得的主要是碱性氨基酸和芳香族氨基酸，BCA则没有选择性；该方法用于大多数蛋白质定量是相当精确的，特别是用于小分子多肽定量，如核糖核酸酶或溶菌酶等。但是，去污剂（裂解液）的浓度超过0.2%则影响定量结果。如TritonX-100，SDS，NP-40等。

（2）BCA法蛋白浓度定量是Cu2+在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成Cu+（Biuret Reaction），Cu+和独特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个Cu+，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

Bradford法蛋白定量是染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收波峰的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH4 ) 2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。

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