dld006-蛋白定量(BCA法)-最强实验protocol(4)

（1）蛋白标准曲线梯度样品的配制

将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml； 蛋白标准品体积（μL） 0 实际按照2.5个孔汇总配制；

单块96孔板（1根标准曲线）（2.5well） 蛋白标准品体积（μL） 应加蛋白标准品体积（μL）

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1 2 4 8 12 16 20 对应蛋白浓度（mg/ml） 0 0.025 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 0 1 2.5 2 5 45 4 8 12 16 20 0 10 20 30 40 50 40 30 20 10 应补充蛋白稀释液体积（μL） 50 47.5 A dld’s Laboratory Manual ? All Rights Reserved

两块96孔板（2根标准曲线）（5well）（样本量较大时） 蛋白标准品体积（μL） 应加蛋白标准品体积（μL） 0 0 1 5 2 10 90 4 8 12 16 20 0 20 40 60 80 100 80 60 40 20 应补充蛋白稀释液体积（μL） 100 95 上述为理想情况；一般实验时，蛋白样本量不会太大，同时制作两根标准曲线也费时费力，一般制作一根即可；如一定要制作两根标准曲线，则检测时，一块96孔板应将全部样品上样（比如都上20倍稀释的样），如此才可以根据该标准曲线进行定量（样品太多跨两块96孔板的话，则涉及到使用哪一根标准曲线的问题）；

（2）待检测蛋白样品的配制

稀释20倍（样品1μL）汇总配方：3.5μL sample + 66.5μL PBS 稀释10倍（样品2μL）汇总配方：7μL sample + 63μL PBS

稀释的目的是因为BCA法测定蛋白浓度有“工作范围”；一般而言，裂解所得的蛋白样品浓度过高，需进行稀释方能检出；常见的稀释倍数为10倍，即2μL样品+18μL PBS；但个别情况浓度还较高，为免重复实验，一般还平行补充一组20倍稀释的样本；

08.根据步骤05估算的总孔数配制BCA工作液；一般以A液体积为

准，忽略B液体积；A液:B液=50:1;

BCA工作液需现用现配，一般在样本加入96孔前配制即可；

09.将步骤07所配置的各“上样蛋白溶液”，按每孔20μL的体积加入

到对应孔中；

① 96孔板在实验时容易看错，操作时应严格“唱名”，一一对应； ② 同一样品同一梯度可不换Tip头，但吸取不同的“上样蛋白溶液”时则需及时更换Tip头；此外，当移液枪残留液体较多时，则每加完一上样孔，需更换Tip头；

③ 先加20μL的“上样蛋白溶液”再加200μL的BCA工作液看似违背加液体的原则（只能小体积加入大体积），但采取此办法，一则加样品时不需要每孔都要换Tip头，二则节约更换Tip头的时间，可以使得各孔内BCA反应更均一；

④ 操作时，96孔板应始终置于冰上；

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A dld’s Laboratory Manual ? All Rights Reserved 10.每检测孔加入200μLBCA工作液；

加BCA工作液前，打匀勿忘记；

11.将待检测96孔板放入37℃生化培养箱内，孵育30 min；

① 也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟；如忘记打开生化培养箱，则放入60℃烘箱内；

② BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间；

12.将待检测96孔板放入酶标仪内，562nm波长处测定OD值；

如实验室的酶标仪非全波长而又没有562nm波长的滤光片，则选取540-595nm之间的其他波长的滤光片进行检测；

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蛋白定量（蛋白总量配平）的数据处理

本次实验酶标仪检测结果如下所示：

01.数据区域划分待用，并审核是否有异常数据；

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