甘草次酸对中药活性成分与血清蛋白结合的影响(3)

　　3.1  甘草次酸与BSA作用的研究

　　3.1.1  甘草次酸对BSA 的荧光猝灭光谱甘草次酸在与BSA 作用的过程中能显著地猝灭BSA 的荧光，这种猝灭在GA加入便可迅速观察到，这提示［10］BSA的一个高亲和结合位点位于色氨酸残基的附近。测得297 K甘草次酸对BSA的荧光猝灭光谱见图1。在此过程中，GA/BSA=3时，最大发射峰由341 nm变为最终的337 nm，略有蓝移，显示色氨酸残基所处环境的疏水性增加。并最终移至334 nm，在研究范围内荧光强度下降87.6％，说明GA和BSA发生了结合作用，并使BSA的构象发生了变化。此外，可以观察到色氨酸荧光下降幅度比酪氨酸大。见图1。

　　3.1.2  荧光猝灭作用的Stern-Volmer分析见图2。图2是根据Stern-Volmer 猝灭方程（方程1）作图，式中，F为有猝灭剂时BSA 的荧光强度, F0为无猝灭剂时BSA 的荧光强度, ［Q］为猝灭剂浓度，KSV 为动态猝灭常数，Kq 为动态荧光猝灭速率常数, 各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×1010  L·mol-1·s-1［1］；τ0 为无猝灭剂时荧光分子的平均寿命。从图2可见，在pH 7.40时，猝灭呈现两种不同的模式，这表明，GA与BSA的有两类不同的结合位点。由斜率求的前半段（［GA］/ ［BSA］≈3），得在297K，Kq=2.47×1013 L·mol-1·s-1, R=0.999 1；在292 K, Kq=2.26×1013  L·mol-1·s-1, R=0.997 5；在287 K, Kq=2.11×1013 L·mol-1·s-1, R=0.998 8。而GA与BSA浓度比大于3之后也有较好的线性，297 K时Kq为2.74×1012 L·mol-1·s-1。很显然，由于由于各类猝灭剂对生物大分子最大扩散控制的碰撞猝灭常数为2.0×1010  L·mol-1·s-1，而由GA引起的BSA的猝灭速率常数远远大于此值，由此可见，GA对BSA的两类猝灭不是动态而是静态猝灭。
   
　　F0/F＝1＋KSV［Q］＝1＋Kqτ0［Q］ ①

　　3.1.3  结合常数假定小分子在生物大分子上有n个相同且独立的结合位点，则小分子与生物大分子的结合平衡可以由方程②［11］ 表示。

    lg(F0-F)/F) =lgK+nlg［Q］②

    这里，K表示某类结合位点的结合常数；n表示一个BSA中某类结合位点能够结合的小分子数目，即结合位点数；［Q］表示游离小分子浓度，在研究中通常以其总浓度代替。根据方程②，以低浓度的GA（GA/BSA＜3）进行试验，求得GA的结合常数和结合位点数分别为：在297 K， K =8.28× 105 L·mol-1， n =1.12 (R=0.998 5) ；292 K ，K =1.60× 105 L·mol-1 n =1.04 (R=0.996 0)；在287 K， K =1.60× 105 L·mol-1, n=0.986 (R=0.998 1) 。                           
    CE-FA测定的药物-蛋白结合数据通过Scatchard作图（方程③）进行处理，方程中，r是结合的药物浓度于蛋白浓度的比率，Df是游离药物浓度，K是结合常数，n是一个蛋白分子的结合位点数。药物结合的百分数（PB）用方程④进行计算。

    r/Df ＝－Kr＋nK    ③

    PB (℅) ＝100 (Dt－Df)/ Dt ④

    图3是GA与BSA结合的Scatchard作图。图中呈现两类不同的线性，根据Scatchard方程，直线在X轴的截距即为结合的位点数，分别为3.0和5.3，所对应的高低亲和位点的结合常数分别为6.70×105 L·mol-1和5.49×104 L·mol-1，该数值与荧光法的结果相近。160 μmol/L的GA在不同浓度的BSA中的结合率如表1所示。蛋白与药物浓度之比为0.375时，结合率已高达95.2％，因此，可以预测，GA在体内是与血清蛋白高度结合的。表1  GA在不同浓度BSA中的结合百分数 （略）

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