3.1.4 甘草次酸与BSA结合的热力学参数及作用力药物小分子与生物大分子的作用力包括氢键，范德华力，静电引力，疏水作用力等，药物不同，与牛血清白蛋白作用力类型也不相同。当温度变化不大的时候，反应的焓变可以视作常数，根据van't Hoff热力学方程（方程⑤）可以计算出药物小分子与生物大分子作用间的有关热力学常数：△G0=-RTlnK=△H0-T△S0; lnK=-△H0/RT+△S0/R ⑤
△H0, △G0, △S0分别表示焓，自由能和熵的变化。根据方程②的结果，在pH 7.40，第一类结合位点的△H0 = 117KJ/mol ，△S0＝507 J/(K.mol)，△H0>0 ，△S0>0，可以推断，GA与BSA的结合力在pH7.40是典型的疏水作用［12］
3.1.5 甘草次酸在BSA结合位点的确定血清白蛋白至少有三个特异的高亲和药物结合位点，分别称为药物结合的site Ⅰ～Ⅲ。血清白蛋白的重要结合位点位于site I 和siteⅡ，分别对应于ⅡA和ⅢA亚结构域。许多药物对血清白蛋白的结合具有特异性，如苯基保泰松（PB）结合于site I，氯灭酸（FA）和布洛芬（IB）结合于siteⅢ，地高辛（digitoxin）结合于site Ⅲ，这些药物可以用作位置探针（site-probe）。本试验利用PB、FA和IB作为位置探针，研究GA与这些药物的竞争结合情况。在与BSA等物质的量的PB、FA和IB存在下，利用方程进行计算，相应的结合常数K的数值分别为，1.72×105，R=0.999 6; 9.04×105，R=0.999 2；9.48×105, R=0.994 8。 考虑到在同样条件下，无探针时结合常数K是8.28×105，显然GA与BSA的结合受到PB的影响较大而几乎不受FA和IB的影响。因此，可以推断site I是GA的高亲和结合位点之一。
3.1.6 甘草次酸与BSA结合距离GA的吸收光谱和BSA的发射光谱存在重叠。根据Fster［11］-偶极非辐射能量转移理论。求重叠光谱的积分，J＝8.926×10-15 cm3·L·mol-1。用K2=2/3, N=1.36, Φ=0.15［1］，求得R0＝2.47 nm，而计算得能量转移效率E＝0.514，最后可以得到GA到色氨酸残基的距离r=2.45 nm。r和R0的数值均在理论的范围内，转移的距离r <7 nm 且0.5R0 < r< 1.5R0 ［11］，显示在GA和BSA之间发生非辐射能量转移的可能性是很大的,从而使荧光猝灭。
3.1.7 圆二色谱研究甘草次酸对BSA构象的影响图4是BSA在GA存在下的圆二色谱。由图可见，BSA在210 nm和220 nm附近有明显的负峰，GA加入使峰强度呈现减少的趋势，GA浓度不大时，强度变化不大。根据文献［11］计算方法，得不同GA浓度下BSA中α螺旋的比例的变化情况（表2），结果表明GA加入对BSA构象产生影响，α螺旋的比例下降。表2 GA存在下BSA (2 μmol/L) 中α螺旋的变化（略）
3.2 甘草次酸对中药活性成分与BSA作用的影响用荧光猝灭法对槲皮素、金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、山萘酚、大黄酸、大黄素、甲基莲心碱与BSA的结合进行了研究，同时探讨了甘草次酸对活性成分结合的影响。所选取的黄酮（苷）和大黄酸、大黄素等都能明显地猝灭BSA的荧光，猝灭数据直接按照方程①、②、⑥行处理，结果（3次平行试验）列于表3。从表可以看出，黄酮比相应的黄酮苷的结合要强，苷元的结合要比对应的苷的结合强。甘草次酸对黄酮苷的结合有很大的影响，结合常数下降54.6%～67.3%。甘草次酸的存在使山萘酚和槲皮素的结合常数有所下降，而对大黄酸、大黄素和甲基莲心碱的结合常数影响较少。从结合常数看，黄酮苷一般在104，而其它几种物质与GA都为105，可见中药活性成分与GA结合常数的相对大小可能是影响甘草次酸能否对其结合产生影响的一个重要因素之一。故甘草次酸可能对其它中药活性成分的药理作用产生影响。表3 甘草次酸对中药活性成分与BSA结合的影响（略）
(F0-F)-1=F0-1+K-1F0-1［Q］-1 ⑥
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