不同治则方药对快速老化小鼠脑组织细胞因子表达的影响(2)

　　1.3 仪器

　　液相芯片分析平台（美国Luminex公司，型号Luminex100）；超低温冰箱（美国Forma公司，型号8525）；台式高速冷冻离心机（德国Beckman公司，型号GS-15R）；电子天平（日本Shimadzu公司，型号AGE120）；纯水器（美国Millipore公司，型号Milli-Q）。

　　2  方法

　　2.1  分组

　　84只7月龄SAMP8小鼠按区组随机法分为模型组、脑复康组、六味地黄汤组、四君子汤组、归脾汤组、当归芍药散组，每组14只；15只SAMR1作为正常对照组。以各种药物的临床用量作为实验小鼠的用药量，根据体重剂量浓度的换算公式［3］换算成小鼠标准体重剂量，按下列分组连续灌胃给药4周。

　　2.2  给药  

　　① 正常对照组：每天给予生理盐水灌胃，0.2 m1/次。 ② 模型组：每天给予生理盐水灌胃，0.2 m1/次。 ③ 六味地黄汤组（0.2 g/20 g）、四君子汤组（0.09 g/20 g）、归脾汤组（0.23 g/20 g）、当归芍药散组（0.34 g/20 g），每天分别按相应的剂量（生药/体重）灌胃。 ④ 脑复康组（阳性药对照）：每天给予脑复康片生理盐水溶液灌胃，按 0.5 g/kg体重给药。

　　2.3 标本制备 

　　各组8月龄SAM小鼠灌胃治疗后，断头取出其双侧海马和双侧皮质作为样本，分离海马组织时参照本室［4］的方法，取出双侧海马放置于0.5 ml的Eppendorf管内，称重，封口，置于-70℃超低温冰箱保存备用。

　　2.4 液相蛋白芯片(Luminex)技术检测 

　　脑组织标本正式检测前从-70℃超低温冰箱取出，以每克组织加入15 ml磷酸盐缓冲液（PBS）的比例，加入0.01 mol/L PBS（内含苯甲基氟磺酸100 mg/L）液，在微型组织研磨器中充分研磨，3 000 g，4℃离心10 min，待测。严格按Upstate公司的Luminex检测试剂盒说明书进行操作。先将50 μl的空白对照缓冲液、不同稀释倍数的标准品和待测样品分别加到可抽滤的96孔微孔板对应孔内，然后加入25 μl抗体交联微球进行反应，室温振荡4 h后，4℃过夜；次日进行真空低压抽滤、缓冲液洗涤，加25μl检测抗体进行反应；室温振荡1.5 h，加入25 μl链亲和素－藻红蛋白荧光素进行标记；室温振荡30 min，加25 μl终止液终止反应，上Luminex 分析平台进行检测。检测完毕后，采用美国MiraiBio公司的MasterPlexTMQT多元数据分析软件（随Luminex 分析平台安装），绘制标准曲线，用四参数法换算出各细胞因子的含量。

　　2.5  统计学处理

　　实验结果用SPSS11.0统计软件处理，所有数据均以 ±s表示，用方差分析对实验数据进行统计。

　　3  结果

　　3.1 各组8月龄SAM小鼠皮质匀浆液10种细胞因子含量的比较 

　　结果见表1。 与正常对照组比较，模型组除了IL-6和IL-10有下降趋势外，其余8种细胞因子含量均呈升高趋势，但只有GM-CSF的含量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。观察各药物治疗组对皮质GM-CSF的影响发现，六味地黄汤组、当归芍药散和阳性对照药脑复康的GM-CSF含量均与正常对照组水平接近（P＞0.05），而四君子汤组和归脾汤组则和模型组一样，明显高于正常对照组（P<0.05或P<0.01）。说明前3种药物能在一定程度上抑制SAMP8小鼠皮质GM-CSF含量的升高。表1  各组SAM小鼠皮质匀浆液10种细胞因子含量的比较（略）与正常对照组比较,﹡P＜0.05,﹡﹡P＜0.01; 与模型组比较, ﹟P＜0.05

　　3.2 各组8月龄SAM小鼠海马匀浆液10种细胞因子含量的比较结果 

　　见表2。 与正常对照组比较，8月龄SAMP8小鼠所有10种细胞因子含量均呈下降趋势，除了TNF-α和IL-5外，其余8种细胞因子含量均明显低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结果提示8月龄SAMP8小鼠脑组织中某些细胞因子表达发生了异常改变。从不同药物组对8月龄SAMP8小鼠海马匀浆液10种细胞因子的影响结果发现，阳性对照药脑复康能提高模型小鼠海马中的IFN-γ，IL-4和IL-12的水平（P<0.05或P<0.01）；当归芍药散能提高模型小鼠海马中的IFN-γ和IL-4的水平（P<0.05）；四君子汤组也能提高模型小鼠海马中的IFN-γ水平（P<0.05）；而六味地黄汤组则能使模型小鼠海马中的GM-CSF，IFN-γ，TNFα，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12等10种细胞因子指标全部显著升高（P<0.05或P<0.01），大多恢复到正常水平。结果表明当该时期SAMP8小鼠海马中的免疫机制出现异常反应时，中药复方六味地黄汤、当归芍药散、四君子汤以及阳性对照药脑复康均能起到一定的调节作用，其中六味地黄汤的作用效果较明显。表2  各组SAM小鼠海马匀浆液10种细胞因子含量的比较（略）

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